Structural Evolution of the Protein Kinase–Like Superfamily
Uma proteina quinase (cinase) é uma enzima quinase (cinase) que modifica outras proteínas adicionando quimicamente a estas grupos fosfato (fosforilação). A fosforiação resulta em geral em uma mudança funcional na proteína mirada (substrato) pela alteração da atividade enzimática, localização celular ou associação com outras proteínas. O genoma humano contém aproximadamente 500 genes de proteínas cinase e eles constituem aproximadamente 2% de todos os genes humanos. As proteínas cinases também são encontradas em bactérias e plantas. Mais de 30% de todas as proteínas podem ser modificadas pela atividade cinase, e as cinases são conhecidas por regular a maioria das vias celulares, especialmente aquelas envolvidas na transdução de sinais.
A família das proteínas cinases é grande e importante, mas é somente uma família em uma grande super-família de cinases homólogas que fosforilam uma variedade de substratos e atuam em importantes papéis em todos os três super-reinos da vida. Nós usamos uma construção estrurural alinhada de cinases selecionadas como base para um estudo da evolução estrutural da evolução da super-família de proteínas de tipo cinase. A comparação das estruturas revelou um domínio do “cerne universal” consistindo somente de regiões requeridas para aligação de ATP e de reação de transferência de fósforo. Notavelmente, sempre dentro do cerne universal algumas estruturas de cinases ostentam notáveis mudanças, enquanto ainda retém a atividade essencial. Portanto, a super-família de tipo cinase tem resistido à revisão substancial estrutural e seqüencial ao longo da escala de tempo evolutiva.
Nós consrtuímos a árvore filogenética para a super-família usando uma nova abordagem que permitiu a combinação da informação da sequência e estrutura dentro de uma análise quantitativa unificada. Quando considerada contra o pano de fundo da distribuição nas espécies e outras medidas, nossa árvore proporciona um cenário convincente para o desenvolvimento de várias famílias de cinases a partir de um ancestral comum. Nós propusemos que a maioria das então chamadas “cinases atípicas” não são intermitentemente derivadas de proteínas cinases, mas além disso divergiam inicialmente na evolução para formar um grupo filogenético distinto. Dentro das cinases atípicas, as famílias de aminoglicosídeos e as cinases colina parecem compartilhar o relacionamento mais próximo. Essas duas famílias, por sua vez, parecem ser as mais próximamente relacionadas à família das proteínas cinases.
(Aminoglicosídeos: qualquer um de um grupo de antibióticos bactericidas derivados de Streptomyces ou Micromonosporum e caracterizados pela ligação de dois ou mais aminoaçúcares unidos por uma ligação licosídica a uma hexose central; os aminoglicosídeos agem ao provocarem a leitura errônea e a inibição da síntese protéica nos ribossomos bacterianos e são efetivos contra bacilos aeróbicos Gram-negativos e Mycobacterium tuberculosis. Ex.: estreptomicina, neomicina e gentamicina.
Colina: íon (2-hidroxieil) trimetilamônico); encontrado na maioria dos tecidos animais na forma livre ou em combinação com lecitina (fosfatidilcolina), acetato (acetilcolina) ou citidina difosfato (citidina difosfocolina). Este é incluído no complexo de vitaminas B; como a acetilcolina (colina esterificada com ácido acético), é essencial para a transmissão sináptica. Vários sinais de colina são usados na medicina. Sin. Lipotropic factor, transmethylation factor.)
Além disso, nossas análises sugerem que a cinase actina-fragmina (não tem no OMIM), uma proteína cinase atípica, é mais restritamente relacionada à família das cinases fofoinositídeo-3 (fosfatidilinositol-3) do que à família das proteínas cinase. As duas famílias mais divergentes, alfa-cinases e cinases fosfadidilinositol fosfato (PIPKs), parecem ter histórias evolucionárias distintas. Enquanto as PIPKs provavelmente tenham um relacionamento evolucionário com o resto da superfamília cinase, o relacionamento parece ser muito distante (e talvez indireto). Por outro lado, as alfa-cinases parecem ser uma exceção no cenário das primeiras divergências para as cinases atípicas: elas aparenemente surgiram relativamente recentemente nos eucariotos. Nós apresentamos possíveis cenários para a derivação das alfa-cinases a partir de um cruzamento existente entre as cinases.
Text Ref:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16244704
domingo, 26 de abril de 2009
sexta-feira, 24 de abril de 2009
300005 METHYL-CpG-BINDING PROTEIN 2; MECP2
Gene map locus Xq28
CLONAGEM
Lewis e outros (1992) identificaram e clonaram a Mecp2 da biblioteca de cDNA do cérebro de um rato. A proteína deduzida em 492 aminoácidos tem uma massa molecular de 53 quilo-dáltons e é rica em aminoácidos básicos e sítios com potencial de fosforilação. Manchas de imunofluorescência mostraram que a distribuição da Mecp2 ao longo dos cromossomos paraleliza com as metil-CpG (dinucleotídio CG cuja citosina foi metilada, recebeu um grupo –CH3). No camundongo, a Mecp2 está concentrada na heterocromatina pericentromérica (na periferia do centrômero), a qual contém aproximadamente 40% de toda metilcitosina-5 genômica. Diferente da proteína 1 de ligação a CpG-metil (MBD1;156535), a MECP2 é capaz de ligar-se a um único par metil-CpG. Nan de outros (1993) clonaram o gene da Mecp2 do rato e definiram o domínio de ligação ao metil CpG (MBD). O MBD tem o comprimento de 85 aminoácidos e liga-se exclusivamente ao DNA que contém uma ou mais CpGs simetricamente metiladas.
Usando uma prova de MECP2 do rato para rastrear uma biblioteca de cDNA do músculo esquelético humano, D’Esposito e outros (1996) isolaram o homólogo humano, o qual codifica uma proteína deduzida em 485 aminoácidos. As proteínas humana e do rato compartilham 93% de identidade de toda a sequência e 100% de identidade na região MBD. Análises de Northern blot detectaram um transcrito de 1.8 quilobases em todos os tecidos analisados, com o nível mais alto de expressão no coração e no músculo esquelético.
Mnatzakanian e outros (2004) identificaram uma isoforma anteriormente desconhecida da MECP2 chamada MECP2B. Eles referiram-se À isoforma conhecida como MECP2A. O transcrito MECP2B utiliza o éxon 1 da MECP2, salta o éxon 2, e depois usa a lente total dos éxons 3 e 4. A MECP2B é expressada em todos os tecidos, incluindo o cérebro fetal e adulto e sub-regiões do cérebro. No cérebo adulto do Homem, a expressão da MECP2B é 10 vezes mais alta do que a da MECP2A.
ESTRUTURA DO GENE
Reichwald e outros (2000) determinaram que o gene MECP2 tem quarto éxons.
MAPEAMENTO
Quaderi e outros (1994) mapearam o gene Mecp2 do camundongo em um interval de 40 quilobases entre a L1cam e Rsvp no centro de expansão do cromossomo X do caundongo, junto ao marcador microsatélite DXMit1. Esta região é conhecida por ser sinteticamente equivalente ao Xq28 humano, e , com exceção do F8A (o FVIII contém uma ilha CpG a partir da qual dois genes são transcritos, o F8A na direção oposta ao FVIII e o F8B na mesma direção.), a ordem dos lócus está conservada entre as duas espécies. Por isso, D’Esposito e outros (1996) esperavam que o gene MECP2 estivesse localizado entre a L1CAM e o lócus de visão colorida RCP/GCP. Um filtro contendo todas as YACs (plasmídio de genoma de levedura) localizadas entre esses dois pontos foi hibridizado com a prova da Mecp2 do rato, e 3 YACs sobrepostas foram positivas para o MECP2, localizando o MECP2 em aproximadamente 70 quilobases centrôméricas em relação ao conjunto de visualização colorida RCP/GCP. Por fluorescência de hibridização em sítio, Vilain e outros (1996) confirmaram a posição de mapeamento da MECP2 no Xq28.
FUNÇÃO DO GENE
A inativação dos genes ligados ao X está usualmente associada com a metilação das ilhas CpG na extremidade 5 do final do gene. Proteínas que reconhecem e ligam-se a bases metiladas no DNA incluem a proteína de ligação a DNA metilado MECP2. Para determinar se este gene é expressado a partir do cromossomo X inativado, Adler e outros (1995) usaram um sistema de translocação autossoma/X (de um cromossomo não sexual para o X) no camundongo, no qual a expressão do alelo Mecp2 no cromossomoX inativado pode ser ensaiada. Os resultados desses experimentos indicaram que a Mecp2 está sujeita à inativação do X no camundongo. D’Esposito e outros (1996) demonstraram que o gene MECP2 em humanos está sujeito à inativação do X.
Para descobrir se a localização da MECP2 na heterocromatina depende da metilação do DNA, Nan e outros (1996) expressaram transitoriamente a fusão protéica Mecp2-LacZ em células cultivadas. A Proteína intacta foi mirada na heterocromatina em células de tipo selvagem mas foi insuficientemente localizada em células mutantes com baixos níveis de metilação do DNA genômico. Deleções dentro da Mecp2 mostraram que a localização na heterocromatina requereu o domínio de 85 aminoácidos de ligação a metil-CpG mas não o restante da proteína. Assim, a Mecp2 é uma proteína de ligação a metil-CpG “in vivo” e é aceitavelmente o maior mediador das conseqüências posteriores à metilação do DNA.
A MECP2 é uma proteína abundante no cromossomo que liga-se expecificamente ao DNA metilado “in vitro” e depende do metil-CpG para sua distribuição no cromossomo “in vivo”. Para avaliar sua significação funcional, Tate e outros (1996) mutaram o gene ligado ao X em células tronco embrionárias de um camundongo macho usando uma construção com um gene alvejador do gene sem promotor contendo um gene repórter lacZ (gene repórter é aquele que leva o gene que está sendo ligado a ele para transfecção em células onde será estudada sua função). As células tronco embrionárias (ES) mutantes carentes da MECP2 cresceram com o mesmo vigor que a linha parental e foram capazes de considerável diferenciação. Embriões quiméricos derivados de várias linhagens mutantes independentes, entretanto, exibiram defeitos no desenvolvimento com uma severidade que foi positivamente correlacionada com a distribuição das células mutantes. Os resultados demonstraram aos autores que a MECP2, assim como a DNA metiltransferase (DNMT1; 126375), é dispensável nas células tronco mas é essencial para o desenvolvimento embrionário.
Nan e outros (1997) descobriram que a Mecp2 recombinante do rato reprimiu a transcrição “in vitro” de promotores metilados mas não reprimiu promotores não metilados. Além disso, a Mecp2 foi capaz de deslocar a histona H1 (HIF1;142709) da cromatina pré-reunida que contém metil-CpG. Essas propriedades, junto com a abundância de Mecp2 e a alta freqüência de seus sítios de ligação de dois pares de bases, sugeriu um papel como um repressor de transcrição global em genomas de vertebrados. Nan e outros (1998) estudaram o mecanismo de repressão pela Mecp2. A Mecp2 liga-se disciplinadamente aos cromossomos de modo dependente da metilação. Ela contém um domínio de repressão transcricional (TRD) que pode funcionar a uma distância “in vitro” e “in vivo”. Nan e outros (1998) mostraram que a região da Mecp2 onde se localiza o TRD associa-se com um complexo co-repressor contendo o repressor transcricional mSin3A e desacetilases de histona (veja HDAC1;601241). A repressão transcricional “in vivo” é ajudada pelo inibidor de desacetilase trichostatina A, indicando que a desacetilação de histonas (e/ou de outras proteínas) é um componente essencial desse mecanismo de repressão. Os dados sugeriram que dois mecanismos globais de regulação do gene, metilação do DNA e desacetilação da histona, podem estar ligados pela Mecp2. Em oócitos de Xenopus (sapo), a metilação do DNA silencia dominantemente a transcrição através da reunição de uma série nucleossômica repressiva. Jones e outros (1998) descobriram que o silenciamento conferido pela Mecp2 e o DNA metilado pode ser ajudado pela inibição da desacetilase da histona, facilitando o remodelamento da cromatina e a ativação transcricional.
(Obs.: As desacetilases de histona (HDAC) são uma classe de enzimas que removem grupos acetil de um ε-N- acetil (acetil epsilon N) do aminoácido lisina em uma histona. Sua ação é oposta à da acetiltransferase de histona. Os caules da histona são normalmente positivamente carregados devido a grupos amina presentes em seus aminoácidos lisina e arginina. Essas cargas positivas ajudam aos caules das histonas a interagirem com e ligarem-se a grupos fosfato negativamente carregados na espinha do DNA. A acetilação, a qual ocorre normalmente numa célula, neutraliza as cargas positivas na histona pela alteração das aminas em amidas e diminui a habilidade das histonas para ligarem-se ao DNA. Esse processo permite a expansão da cromatina, permitindo à transcrição genética ter lugar. As desacetilases das histonas removem estes grupos acetil, aumentando a carga positiva dos caules das histonas e aumentando a ligação de alta afinidade entre as histonas e a coluna de DNA. Este processo condensa a estrutura de DNA prevenindo a transcrição.In.bioisolutions.blogspot.com Obs.2: a repressão transcricional se refere à repressão da transcrição de um gene e, para isso, a cromatina tem que estar solta da histona.)
Ohki e outros (2001) relataram a estrutura em solução do MBD conservado do MBD1 humano ligado ao DNA metilado. A ligação ao DNA cria um laço no MBD1 para dobrar para dentro de uma nova e principal interface de ligação ao DNA. O reconhecimanto de grupos metil e sequências CG no sítio de metilação é devido a 5 resíduos altamente conservados que formam uma área hidrofóbica. Os autores concluíram que a estrutura indica como o MBD pode acesar o nucleossomo do DNA sem encontrar interferência dos estérica (interferência estérica é o bloqueio bioquímico devido ao tamanho das moléculas reagentes que impediria a aproximação necessária para a interação entre os átomos) do cerne das histonas.
Shahbazian e outros (2002) investigaram a distribuição espacial e temporal da proteína Mecp2 durante o desenvolvimento do camundongo e do homem. Através de análises de Western blot, eles descobriram que a Mecp2 no camundongo adulto e abundante no cérebro, pulmões, e baço, pouca no coração e rins e escassamente detectável no fígado, estômago e intestino delgado. Não existe correlação óbvia entre os níveis da proteína e os níveis de RNA, sugerindo que a tradução deva ser regulada pós-transcricionalmente por fatores específicos dos tecidos. O período de tempo de expressão da Mecp2 no camundongo e no homem correlacionou-se à maturação do sistema nervoso central, com a estruturas mais velhas ontogeneticamente (com estruturas anteriores no desenvolvimento do indivíduo) tais como o cordão da espinha e o tronco encefálico tornando-se positivo antes das novas estruturas tais como o hipocampo e o córtex cerebral. No córtex, a Mecp2 apareceu primeiro nas células Cajal-Retzius, depois nos neurônios das camadas corticais mais profundas e mais maduras. A proteína Mecp2 estava eventualmente presente em uma maioria de neurônios mas ausente nas células gliais. Shahbazian e outros (2002) sugeriram que a Mecp2 pode tornar-se abundante somente uma vez que um neurônio tenha alcançado um certo grau de maturidade.
Chen e outros (2003) descobriram que a MECP2 liga-se seletivamente ao promotor III do BDNF (113505) e funciona para reprimir a expressão do gene BDNF (OMIM 113505: Durante o desenvolvimento vertebral normal, mais de 80% dos neurônios em diversas populações de células dentro do sistema nervoso em formação morre. Pensa-se que este é um mecanismo que adequa números de neurônios a estabilizarem a apropriada densidade de inervação com órgãos efetores ou outras populações neuronais. E várias instâncias, a mira de inervação de uma população de neurônios tem sido mostrada por ter um papel crucial na regulação de neurônios sobreviventes. Alvos de inervação neuronal produzem um limitado suprimento de fatores neurotróficos, e a competição entre os neurônios respondedores a estes fatores determina qual neurônio sobreviverá. Em adoção ao fator de crescimento do nervo (NGF;162030), o BDNF tem sido purificado a mostrado in vivo por reduzir a quantidade de morte celular neuronal ocorrendo naturalmente em porções do sistema nervoso periférico (Hofer e Barde, 1988). A despolarização da membrana dispara a fosforilação dependente de cálcio e a liberação da MECP2 do promotor III do BDNF, dessa forma facilitando a transcrição. Chen e outros (2003) concluíram que a MECP2 atua num papel chave no controle da atividade neuronal dependente da regulação do gene e que a desregulação desse processo pode apoiar a patologia da síndrome de Rett (312750).
Martinowich e outros (2003) relataram que o aumento na síntese do BDNF em neurônios do camundongo após a despolarização correlaciona-se com uma diminuição na metilação da CpG dentro da região regulatória do gene BDNF. Além disso, a transcrição aumentada do BDNF envolve a dissociação do complexo de repressão MECP2-desacetilase de histona-Sin3A do seu promotor. (Sin3A; 607776 - Obs.: Complexos protéicos contendo SIN3A atuam como co-repressores dependentes da desacetilase de histona (veja HDAC1;601241). A SIN3A atua contém múltiplos domínios de interação proteína-proteína e serve como uma estrutura na qual o complexo co-repressor se reúne (Fleischer e outros, 2003). Martinowich e outros (2003) concluíram que o remodelamento da cromatina relacionado à metilação do DNA é importante para a regulação da atividade dependente do gene que pode ser crítica para a plasticidade neural.
Martinowich e outros (2003) propuseram um modelo no qual a metilação do DNA e seu relacionado remodelamento da cromatina atual em papéis críticos na regulação da transcrição do gene em resposta à atividade neuronal. A metilação CpG em qualquer sítio crítico pode aumentar a probabilidade de ligação da MECP2, a qual pode recrutar desacetilases de histona e a H3-K9 metiltransferase para mediar o remodelamento da cromatina inativa, ou pode diretamente induzir a compactação da cromatina para reprimir a expressão do gene.
Em embriões Xenopus, Stancheva e outros (2003) descobriram que a Mecp2 com o truncamento R168X (de Arg para ter. Pode ser de Arg [caa para fim taa, ou de arg aga para fim tga]?) não foi capaz de interagir com o complexo Smrt (NCOR2;600848: Co-repressor de receptor nuclear. O silenciamento transcricional mediado por receptores nucleares é importante no desenvolvimento, diferenciação e oncogênese. O mecanismo que dá suporte esse efeito é uma chave para o entendimento das bases moleculares da ação hormonal. Chen e Evans (1995) identificaram um fator de interação a receptor, o qual eles designaram SMRT, como um mediador de silenciamento (co-repressor) para receptores de hormônio da tiróide e retinóides (derivados de ácido retinóico)) ou ativar completamente a Hiry2a, um repressor neuronal regulado pela Notch, durante a neurogênese primária. Esse rompimento da atividade da Mecp2 resultou no padrão anormal dos neurônios primários durante a diferenciação neuronal.
Expressando cDNAs de roedores em células embrionárias de rim human, Kimura e Shiota (2003) mostraram que a Dnmt1 interagia diretamente com a Mecp2. A Dnmt1 formou complexos com as HDAC bem como com a Mecp2, mas a interação de Mecp2 com a Dnmt1 não ligava-se à Hdac1. A Mecp2 pode formar complexos com DNA fartamente metilado e semi-metilado. Os complexos de Mecp2 imunopreciptados mostraram a atividade da metiltransferase no DNA semi-metilado. Kimura e Shiota (2003) concluíram que a DNMT1 associa-se à MECP2 de modo a desempenhar a manutenção da metilação durante a divisão celular.
Georgel e outros (2003) usaram criomicroscopia e tomografia de microscópio eletrônico para caracterizar complexos formados entre a MECP2 humana recombinante e 12-mer séries nucleossômicas (séries de 12 nucleossomos? Obs.: Nucleossomo é cada unidade de histona enrolada pela fita de DNA). Em taxas molares de perto de uma MECP2 por nucleossomo, a ligação de MECP2 converteu a extensão da série de nucleossomos em estruturas compactadas de 60S elipsoidais. Em taxas molares de mais de um MECP2 por nucleossoma, as partículas 60S reuniram-se em supra-estruturas oligoméricas morfologicamente definidas. A habilidade da MECP2 para mediar a compactação da cromatina não requer seu MBD. Georgel e outros (2003) concluíram que a MECP2 é uma proteína de condensação da cromatina que media a reunião de novas estruturas secundárias da cromatina ( obs.: o dobramento da cromatina em estruturas secundárias).
Harikrishnan e outros (2005) descobriram que a BRM (SMARCA2;600014) associou-se com a MECP2 nos fibroblastos do camundongo e em células de leucemia linfoblástica T humanas, e a associação era funcionalmente relacionada com a repressão. A metilação do promotor especificou o recrutamento da MECP2 e da BRM, e a inibição da metilação causou sua liberação. O complexo co-repressor MECP2-BRM foi recrutado diretamente para o gene FMR1 (omim 309550 - Xq27.3 : A proteina de ligação seletiva a RNA FMRP forma um complexo ribonucleoproteico mensageiro que se associa com poli-ribossomos, sugerindo que ela esteja envolvida na tradução (Jin e outros, 2004). O gene FMR1 está mutado na syndrome mental do X frágil (300624) e na syndrome de ataxia (incapacidade de controlar o movimento muscular voluntário (tremor) (FXTAS; 300623))., e a deleção somática em células de X frágil aliviou a repressão. Harikrishnan e outros (2005) concluíram que ambos a MECP2 e o complexo SWI/SNF estão envolvidos na repressão dos genes.
Klose e outros (2005) descobriram que sítios genômicos ocupados pela MECP2 e pela MBD2 (603547) eram principalmente mutuamente exclusivos. A MBD2 era capaz de colonizar sítios vagos pela depleção da MECP2, mas o inverso não ocorre. A seleção artificial de sítios de ligação da MECP2 “in vitro” demonstrou que a MECP2 requereu uma corrida de A/T de quatro ou mais pares de bases adjacentes ao grupo metil-CpG para a ligação eficiente ao DNA. Klose e outros (2005) concluíram que o metil-CpG é necessário, mas não é o suficiente para a ligação da MECP2.
Nan e outros (2007) descobriram que a MECP2 interage com a STRX (300032), uma DNA helicase/ATPase que está mutada na síndrome do retardamento mental/alfa-talassemia (301040). Estudos em células cultivadas de camundongos mostraram que a MECP2 mirou o domínio C terminal helicase da ATRX para focos da heterocromatina. A localização da ATRX na heterocromatina foi atrapalhada em neurônios de camundongos nulos para Mecp2. Os achados sugerem que o rompimento da interação entre a MECP2 e a ATRX leva à alterações patológicas que contribuem para o retardamento mental.
Schule e outros (2007) descobriram que células linfoblastóides e células do cérebro de pacientes com mutações em MECP2 mostraram impressão normal dos genes gravados PEG3 (601483) e PEG10 (609810), indicando que a proteína MECP2 não é necessária para que a impressão normal ocorra.
Chahrour e outros (2008) examinaram padrões de expressão do gene no hipotálamo de camundongos que ou careciam ou expressavam demais a MECP2. Em ambos os modelos, a disfunção da MECP2 induziu mudanças nos níveis de expressão de centenas de genes, mas como esperado, a maioria dos genes (aproximadamente 85%) pareceu ser ativada pela MECP2. Chahrour e outros (2008) então, selecionaram 6 genes, SST (182450), OPRK1 (165196), MEF2C (600662), GAMT (601240), GPRIN1 (611239), e A2BP1 (605104), e confirmaram que a MECP2 liga-se a seus promotores. Além disso, Chahrour e outros (2008) mostraram que a MECP2 associa-se com o ativador ranscricional CREB1 (123810) no promotor de um alvo ativado, mas não a um alvo reprimido. Chahrour e outros (2008) concluíram que seus estudos sugeriram que a MECP2 regula a expressão de uma ampla escala de genes no hipotálamo e que ela pode funcionar como um ativador ou como um repressor da transcrição.
Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=300005
Gene map locus Xq28
CLONAGEM
Lewis e outros (1992) identificaram e clonaram a Mecp2 da biblioteca de cDNA do cérebro de um rato. A proteína deduzida em 492 aminoácidos tem uma massa molecular de 53 quilo-dáltons e é rica em aminoácidos básicos e sítios com potencial de fosforilação. Manchas de imunofluorescência mostraram que a distribuição da Mecp2 ao longo dos cromossomos paraleliza com as metil-CpG (dinucleotídio CG cuja citosina foi metilada, recebeu um grupo –CH3). No camundongo, a Mecp2 está concentrada na heterocromatina pericentromérica (na periferia do centrômero), a qual contém aproximadamente 40% de toda metilcitosina-5 genômica. Diferente da proteína 1 de ligação a CpG-metil (MBD1;156535), a MECP2 é capaz de ligar-se a um único par metil-CpG. Nan de outros (1993) clonaram o gene da Mecp2 do rato e definiram o domínio de ligação ao metil CpG (MBD). O MBD tem o comprimento de 85 aminoácidos e liga-se exclusivamente ao DNA que contém uma ou mais CpGs simetricamente metiladas.
Usando uma prova de MECP2 do rato para rastrear uma biblioteca de cDNA do músculo esquelético humano, D’Esposito e outros (1996) isolaram o homólogo humano, o qual codifica uma proteína deduzida em 485 aminoácidos. As proteínas humana e do rato compartilham 93% de identidade de toda a sequência e 100% de identidade na região MBD. Análises de Northern blot detectaram um transcrito de 1.8 quilobases em todos os tecidos analisados, com o nível mais alto de expressão no coração e no músculo esquelético.
Mnatzakanian e outros (2004) identificaram uma isoforma anteriormente desconhecida da MECP2 chamada MECP2B. Eles referiram-se À isoforma conhecida como MECP2A. O transcrito MECP2B utiliza o éxon 1 da MECP2, salta o éxon 2, e depois usa a lente total dos éxons 3 e 4. A MECP2B é expressada em todos os tecidos, incluindo o cérebro fetal e adulto e sub-regiões do cérebro. No cérebo adulto do Homem, a expressão da MECP2B é 10 vezes mais alta do que a da MECP2A.
ESTRUTURA DO GENE
Reichwald e outros (2000) determinaram que o gene MECP2 tem quarto éxons.
MAPEAMENTO
Quaderi e outros (1994) mapearam o gene Mecp2 do camundongo em um interval de 40 quilobases entre a L1cam e Rsvp no centro de expansão do cromossomo X do caundongo, junto ao marcador microsatélite DXMit1. Esta região é conhecida por ser sinteticamente equivalente ao Xq28 humano, e , com exceção do F8A (o FVIII contém uma ilha CpG a partir da qual dois genes são transcritos, o F8A na direção oposta ao FVIII e o F8B na mesma direção.), a ordem dos lócus está conservada entre as duas espécies. Por isso, D’Esposito e outros (1996) esperavam que o gene MECP2 estivesse localizado entre a L1CAM e o lócus de visão colorida RCP/GCP. Um filtro contendo todas as YACs (plasmídio de genoma de levedura) localizadas entre esses dois pontos foi hibridizado com a prova da Mecp2 do rato, e 3 YACs sobrepostas foram positivas para o MECP2, localizando o MECP2 em aproximadamente 70 quilobases centrôméricas em relação ao conjunto de visualização colorida RCP/GCP. Por fluorescência de hibridização em sítio, Vilain e outros (1996) confirmaram a posição de mapeamento da MECP2 no Xq28.
FUNÇÃO DO GENE
A inativação dos genes ligados ao X está usualmente associada com a metilação das ilhas CpG na extremidade 5 do final do gene. Proteínas que reconhecem e ligam-se a bases metiladas no DNA incluem a proteína de ligação a DNA metilado MECP2. Para determinar se este gene é expressado a partir do cromossomo X inativado, Adler e outros (1995) usaram um sistema de translocação autossoma/X (de um cromossomo não sexual para o X) no camundongo, no qual a expressão do alelo Mecp2 no cromossomoX inativado pode ser ensaiada. Os resultados desses experimentos indicaram que a Mecp2 está sujeita à inativação do X no camundongo. D’Esposito e outros (1996) demonstraram que o gene MECP2 em humanos está sujeito à inativação do X.
Para descobrir se a localização da MECP2 na heterocromatina depende da metilação do DNA, Nan e outros (1996) expressaram transitoriamente a fusão protéica Mecp2-LacZ em células cultivadas. A Proteína intacta foi mirada na heterocromatina em células de tipo selvagem mas foi insuficientemente localizada em células mutantes com baixos níveis de metilação do DNA genômico. Deleções dentro da Mecp2 mostraram que a localização na heterocromatina requereu o domínio de 85 aminoácidos de ligação a metil-CpG mas não o restante da proteína. Assim, a Mecp2 é uma proteína de ligação a metil-CpG “in vivo” e é aceitavelmente o maior mediador das conseqüências posteriores à metilação do DNA.
A MECP2 é uma proteína abundante no cromossomo que liga-se expecificamente ao DNA metilado “in vitro” e depende do metil-CpG para sua distribuição no cromossomo “in vivo”. Para avaliar sua significação funcional, Tate e outros (1996) mutaram o gene ligado ao X em células tronco embrionárias de um camundongo macho usando uma construção com um gene alvejador do gene sem promotor contendo um gene repórter lacZ (gene repórter é aquele que leva o gene que está sendo ligado a ele para transfecção em células onde será estudada sua função). As células tronco embrionárias (ES) mutantes carentes da MECP2 cresceram com o mesmo vigor que a linha parental e foram capazes de considerável diferenciação. Embriões quiméricos derivados de várias linhagens mutantes independentes, entretanto, exibiram defeitos no desenvolvimento com uma severidade que foi positivamente correlacionada com a distribuição das células mutantes. Os resultados demonstraram aos autores que a MECP2, assim como a DNA metiltransferase (DNMT1; 126375), é dispensável nas células tronco mas é essencial para o desenvolvimento embrionário.
Nan e outros (1997) descobriram que a Mecp2 recombinante do rato reprimiu a transcrição “in vitro” de promotores metilados mas não reprimiu promotores não metilados. Além disso, a Mecp2 foi capaz de deslocar a histona H1 (HIF1;142709) da cromatina pré-reunida que contém metil-CpG. Essas propriedades, junto com a abundância de Mecp2 e a alta freqüência de seus sítios de ligação de dois pares de bases, sugeriu um papel como um repressor de transcrição global em genomas de vertebrados. Nan e outros (1998) estudaram o mecanismo de repressão pela Mecp2. A Mecp2 liga-se disciplinadamente aos cromossomos de modo dependente da metilação. Ela contém um domínio de repressão transcricional (TRD) que pode funcionar a uma distância “in vitro” e “in vivo”. Nan e outros (1998) mostraram que a região da Mecp2 onde se localiza o TRD associa-se com um complexo co-repressor contendo o repressor transcricional mSin3A e desacetilases de histona (veja HDAC1;601241). A repressão transcricional “in vivo” é ajudada pelo inibidor de desacetilase trichostatina A, indicando que a desacetilação de histonas (e/ou de outras proteínas) é um componente essencial desse mecanismo de repressão. Os dados sugeriram que dois mecanismos globais de regulação do gene, metilação do DNA e desacetilação da histona, podem estar ligados pela Mecp2. Em oócitos de Xenopus (sapo), a metilação do DNA silencia dominantemente a transcrição através da reunição de uma série nucleossômica repressiva. Jones e outros (1998) descobriram que o silenciamento conferido pela Mecp2 e o DNA metilado pode ser ajudado pela inibição da desacetilase da histona, facilitando o remodelamento da cromatina e a ativação transcricional.
(Obs.: As desacetilases de histona (HDAC) são uma classe de enzimas que removem grupos acetil de um ε-N- acetil (acetil epsilon N) do aminoácido lisina em uma histona. Sua ação é oposta à da acetiltransferase de histona. Os caules da histona são normalmente positivamente carregados devido a grupos amina presentes em seus aminoácidos lisina e arginina. Essas cargas positivas ajudam aos caules das histonas a interagirem com e ligarem-se a grupos fosfato negativamente carregados na espinha do DNA. A acetilação, a qual ocorre normalmente numa célula, neutraliza as cargas positivas na histona pela alteração das aminas em amidas e diminui a habilidade das histonas para ligarem-se ao DNA. Esse processo permite a expansão da cromatina, permitindo à transcrição genética ter lugar. As desacetilases das histonas removem estes grupos acetil, aumentando a carga positiva dos caules das histonas e aumentando a ligação de alta afinidade entre as histonas e a coluna de DNA. Este processo condensa a estrutura de DNA prevenindo a transcrição.In.bioisolutions.blogspot.com Obs.2: a repressão transcricional se refere à repressão da transcrição de um gene e, para isso, a cromatina tem que estar solta da histona.)
Ohki e outros (2001) relataram a estrutura em solução do MBD conservado do MBD1 humano ligado ao DNA metilado. A ligação ao DNA cria um laço no MBD1 para dobrar para dentro de uma nova e principal interface de ligação ao DNA. O reconhecimanto de grupos metil e sequências CG no sítio de metilação é devido a 5 resíduos altamente conservados que formam uma área hidrofóbica. Os autores concluíram que a estrutura indica como o MBD pode acesar o nucleossomo do DNA sem encontrar interferência dos estérica (interferência estérica é o bloqueio bioquímico devido ao tamanho das moléculas reagentes que impediria a aproximação necessária para a interação entre os átomos) do cerne das histonas.
Shahbazian e outros (2002) investigaram a distribuição espacial e temporal da proteína Mecp2 durante o desenvolvimento do camundongo e do homem. Através de análises de Western blot, eles descobriram que a Mecp2 no camundongo adulto e abundante no cérebro, pulmões, e baço, pouca no coração e rins e escassamente detectável no fígado, estômago e intestino delgado. Não existe correlação óbvia entre os níveis da proteína e os níveis de RNA, sugerindo que a tradução deva ser regulada pós-transcricionalmente por fatores específicos dos tecidos. O período de tempo de expressão da Mecp2 no camundongo e no homem correlacionou-se à maturação do sistema nervoso central, com a estruturas mais velhas ontogeneticamente (com estruturas anteriores no desenvolvimento do indivíduo) tais como o cordão da espinha e o tronco encefálico tornando-se positivo antes das novas estruturas tais como o hipocampo e o córtex cerebral. No córtex, a Mecp2 apareceu primeiro nas células Cajal-Retzius, depois nos neurônios das camadas corticais mais profundas e mais maduras. A proteína Mecp2 estava eventualmente presente em uma maioria de neurônios mas ausente nas células gliais. Shahbazian e outros (2002) sugeriram que a Mecp2 pode tornar-se abundante somente uma vez que um neurônio tenha alcançado um certo grau de maturidade.
Chen e outros (2003) descobriram que a MECP2 liga-se seletivamente ao promotor III do BDNF (113505) e funciona para reprimir a expressão do gene BDNF (OMIM 113505: Durante o desenvolvimento vertebral normal, mais de 80% dos neurônios em diversas populações de células dentro do sistema nervoso em formação morre. Pensa-se que este é um mecanismo que adequa números de neurônios a estabilizarem a apropriada densidade de inervação com órgãos efetores ou outras populações neuronais. E várias instâncias, a mira de inervação de uma população de neurônios tem sido mostrada por ter um papel crucial na regulação de neurônios sobreviventes. Alvos de inervação neuronal produzem um limitado suprimento de fatores neurotróficos, e a competição entre os neurônios respondedores a estes fatores determina qual neurônio sobreviverá. Em adoção ao fator de crescimento do nervo (NGF;162030), o BDNF tem sido purificado a mostrado in vivo por reduzir a quantidade de morte celular neuronal ocorrendo naturalmente em porções do sistema nervoso periférico (Hofer e Barde, 1988). A despolarização da membrana dispara a fosforilação dependente de cálcio e a liberação da MECP2 do promotor III do BDNF, dessa forma facilitando a transcrição. Chen e outros (2003) concluíram que a MECP2 atua num papel chave no controle da atividade neuronal dependente da regulação do gene e que a desregulação desse processo pode apoiar a patologia da síndrome de Rett (312750).
Martinowich e outros (2003) relataram que o aumento na síntese do BDNF em neurônios do camundongo após a despolarização correlaciona-se com uma diminuição na metilação da CpG dentro da região regulatória do gene BDNF. Além disso, a transcrição aumentada do BDNF envolve a dissociação do complexo de repressão MECP2-desacetilase de histona-Sin3A do seu promotor. (Sin3A; 607776 - Obs.: Complexos protéicos contendo SIN3A atuam como co-repressores dependentes da desacetilase de histona (veja HDAC1;601241). A SIN3A atua contém múltiplos domínios de interação proteína-proteína e serve como uma estrutura na qual o complexo co-repressor se reúne (Fleischer e outros, 2003). Martinowich e outros (2003) concluíram que o remodelamento da cromatina relacionado à metilação do DNA é importante para a regulação da atividade dependente do gene que pode ser crítica para a plasticidade neural.
Martinowich e outros (2003) propuseram um modelo no qual a metilação do DNA e seu relacionado remodelamento da cromatina atual em papéis críticos na regulação da transcrição do gene em resposta à atividade neuronal. A metilação CpG em qualquer sítio crítico pode aumentar a probabilidade de ligação da MECP2, a qual pode recrutar desacetilases de histona e a H3-K9 metiltransferase para mediar o remodelamento da cromatina inativa, ou pode diretamente induzir a compactação da cromatina para reprimir a expressão do gene.
Em embriões Xenopus, Stancheva e outros (2003) descobriram que a Mecp2 com o truncamento R168X (de Arg para ter. Pode ser de Arg [caa para fim taa, ou de arg aga para fim tga]?) não foi capaz de interagir com o complexo Smrt (NCOR2;600848: Co-repressor de receptor nuclear. O silenciamento transcricional mediado por receptores nucleares é importante no desenvolvimento, diferenciação e oncogênese. O mecanismo que dá suporte esse efeito é uma chave para o entendimento das bases moleculares da ação hormonal. Chen e Evans (1995) identificaram um fator de interação a receptor, o qual eles designaram SMRT, como um mediador de silenciamento (co-repressor) para receptores de hormônio da tiróide e retinóides (derivados de ácido retinóico)) ou ativar completamente a Hiry2a, um repressor neuronal regulado pela Notch, durante a neurogênese primária. Esse rompimento da atividade da Mecp2 resultou no padrão anormal dos neurônios primários durante a diferenciação neuronal.
Expressando cDNAs de roedores em células embrionárias de rim human, Kimura e Shiota (2003) mostraram que a Dnmt1 interagia diretamente com a Mecp2. A Dnmt1 formou complexos com as HDAC bem como com a Mecp2, mas a interação de Mecp2 com a Dnmt1 não ligava-se à Hdac1. A Mecp2 pode formar complexos com DNA fartamente metilado e semi-metilado. Os complexos de Mecp2 imunopreciptados mostraram a atividade da metiltransferase no DNA semi-metilado. Kimura e Shiota (2003) concluíram que a DNMT1 associa-se à MECP2 de modo a desempenhar a manutenção da metilação durante a divisão celular.
Georgel e outros (2003) usaram criomicroscopia e tomografia de microscópio eletrônico para caracterizar complexos formados entre a MECP2 humana recombinante e 12-mer séries nucleossômicas (séries de 12 nucleossomos? Obs.: Nucleossomo é cada unidade de histona enrolada pela fita de DNA). Em taxas molares de perto de uma MECP2 por nucleossomo, a ligação de MECP2 converteu a extensão da série de nucleossomos em estruturas compactadas de 60S elipsoidais. Em taxas molares de mais de um MECP2 por nucleossoma, as partículas 60S reuniram-se em supra-estruturas oligoméricas morfologicamente definidas. A habilidade da MECP2 para mediar a compactação da cromatina não requer seu MBD. Georgel e outros (2003) concluíram que a MECP2 é uma proteína de condensação da cromatina que media a reunião de novas estruturas secundárias da cromatina ( obs.: o dobramento da cromatina em estruturas secundárias).
Harikrishnan e outros (2005) descobriram que a BRM (SMARCA2;600014) associou-se com a MECP2 nos fibroblastos do camundongo e em células de leucemia linfoblástica T humanas, e a associação era funcionalmente relacionada com a repressão. A metilação do promotor especificou o recrutamento da MECP2 e da BRM, e a inibição da metilação causou sua liberação. O complexo co-repressor MECP2-BRM foi recrutado diretamente para o gene FMR1 (omim 309550 - Xq27.3 : A proteina de ligação seletiva a RNA FMRP forma um complexo ribonucleoproteico mensageiro que se associa com poli-ribossomos, sugerindo que ela esteja envolvida na tradução (Jin e outros, 2004). O gene FMR1 está mutado na syndrome mental do X frágil (300624) e na syndrome de ataxia (incapacidade de controlar o movimento muscular voluntário (tremor) (FXTAS; 300623))., e a deleção somática em células de X frágil aliviou a repressão. Harikrishnan e outros (2005) concluíram que ambos a MECP2 e o complexo SWI/SNF estão envolvidos na repressão dos genes.
Klose e outros (2005) descobriram que sítios genômicos ocupados pela MECP2 e pela MBD2 (603547) eram principalmente mutuamente exclusivos. A MBD2 era capaz de colonizar sítios vagos pela depleção da MECP2, mas o inverso não ocorre. A seleção artificial de sítios de ligação da MECP2 “in vitro” demonstrou que a MECP2 requereu uma corrida de A/T de quatro ou mais pares de bases adjacentes ao grupo metil-CpG para a ligação eficiente ao DNA. Klose e outros (2005) concluíram que o metil-CpG é necessário, mas não é o suficiente para a ligação da MECP2.
Nan e outros (2007) descobriram que a MECP2 interage com a STRX (300032), uma DNA helicase/ATPase que está mutada na síndrome do retardamento mental/alfa-talassemia (301040). Estudos em células cultivadas de camundongos mostraram que a MECP2 mirou o domínio C terminal helicase da ATRX para focos da heterocromatina. A localização da ATRX na heterocromatina foi atrapalhada em neurônios de camundongos nulos para Mecp2. Os achados sugerem que o rompimento da interação entre a MECP2 e a ATRX leva à alterações patológicas que contribuem para o retardamento mental.
Schule e outros (2007) descobriram que células linfoblastóides e células do cérebro de pacientes com mutações em MECP2 mostraram impressão normal dos genes gravados PEG3 (601483) e PEG10 (609810), indicando que a proteína MECP2 não é necessária para que a impressão normal ocorra.
Chahrour e outros (2008) examinaram padrões de expressão do gene no hipotálamo de camundongos que ou careciam ou expressavam demais a MECP2. Em ambos os modelos, a disfunção da MECP2 induziu mudanças nos níveis de expressão de centenas de genes, mas como esperado, a maioria dos genes (aproximadamente 85%) pareceu ser ativada pela MECP2. Chahrour e outros (2008) então, selecionaram 6 genes, SST (182450), OPRK1 (165196), MEF2C (600662), GAMT (601240), GPRIN1 (611239), e A2BP1 (605104), e confirmaram que a MECP2 liga-se a seus promotores. Além disso, Chahrour e outros (2008) mostraram que a MECP2 associa-se com o ativador ranscricional CREB1 (123810) no promotor de um alvo ativado, mas não a um alvo reprimido. Chahrour e outros (2008) concluíram que seus estudos sugeriram que a MECP2 regula a expressão de uma ampla escala de genes no hipotálamo e que ela pode funcionar como um ativador ou como um repressor da transcrição.
Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=300005
domingo, 19 de abril de 2009
ENZYMES
As enzimas são biomoléculas catalisadoras. Quase todas são proteínas. Em reações enzimáticas, as moléculas no começo do processo, são chamadas substratos, e a enzima as converte em diferentes moléculas, os produtos. Quase todos os processos em uma célula biológica precisam de enzimas para ocorrer em taxas significativas. Sendo as enzimas seletivas para seus substratos e acelerando somente algumas reações de entre muitas possibilidades, o conjunto de enzimas produzido em uma célula determina quais ias metabólicas ocorrem naquela célula.
Como em todas as catálises, as enzimas trabalham por redução da ativação de energia (Ea ou ∆G‡) para uma reação, aumentando assim a taxa de reação. A maioria das taxas de reação enzimática é milhões de vezes mais rápida em comparação àquelas em reações não catalisadas. Entretanto, as enzimas diferem realmente da maioria dos outros catalizadores por serem muito mais específicas. As enzimas são conhecidas por catalisarem aproximadamente 4.000 reações. Algumas moléculas de RNA chamadas ribozimas catalisam reações, com o importante exemplo de serem alguma parte do ribossomo. Moléculas sintéticas chamadas enzimas artificiais também exibem catálise de tipo enzimática.
A atividade da enzima pode ser afetada por outras moléculas. Inibidores são moléculas que reduzem a atividade da enzima; ativadores são as que aumentam a atividade. Muidas drogas e remédios são inibidores de enzimas. A atividade também é afetada pela temperatura, meio-ambiente químico (e.g, pH), e a concentração do substrato. Algumas enzimas são usadas comercialmente, por exemplo, na síntese de antibióticos. Além disso, alguns produtos domésticos usam enzimas para acelerar reações bioquímicas e mecanismos. As enzimas são geralmente proteínas globulares (esféricas) e atingem de apenas 62 resíduos de aminoácidos de tamanho, como o monômero da tautomerase do oxalocronato 4, a mais de 2.500 resíduos na sintetase de ácido graxo. Um pequeno número de catálises biológicas baseadas em RNA existe, sendo as mais comuns no ribossomo; essas são referidas tanto como enzimas de RNA ou ribozimas. As atividades das enzimas são determinadas por sua estrutura tri-dimensional. Entretanto, embora a estrutura realmente determine a função, a previsão de uma nova atividade da enzima partindo-se apenas de sua estrutura é um problema muito difícil que ainda não foi solucionado.
A maioria das enzimas é muito maior que os substratos sobre os quais atua, e somente uma pequena porção da enzima (por volta de 3 a 4 aminoácidos) está diretamente envolvida na catálise. A região que contém esses resíduos catalíticos, liga-se ao substrato, e que conclui a reação é conhecida como sítio ativo. As enzimas também podem conter sítios que ligam co-fatores, os quais são necessários à catálise. Algumas enzimas também têm sítios de ligação para pequenas moléculas, as quais são frequentemente produtos ou substratos diretos ou indiretos da reação catalisada. Essa ligação pode servir para aumentar ou diminuir a atividade da enzima, proporcionando meios para regulação de retorno.
Como todas as proteínas, as enzimas são feitas da mesma forma, cadeias lineares de aminoácidos que se dobram para produzir um produto tri-dimensional. Cada única sequência de aminoácido produz uma estrutura específica, a qual tem propriedades únicas. Cadeias protéicas individuais podem, algumas vezes, agrupar-se formando um complexo proteico. A maioria das enzimas pode ser desnaturada, ou seja, desdobradas e inativadas, por desnaturadores químicos ou caloríficos, os quais rompem a estrutura tri-dimensional da proteína. Dependendo da enzima, a desnaturação pode ser reversível ou irreversível.
MECANISMOS
As enzimas podem atuar em várias vias, todas as quais abaixo de ΔG‡:
- reduzindo a ativação de energia através da criação de um meio ambiente no qual o estado de transição está estabilizado (ou seja, pressionado a forma de um substrato pela ligação da conformação do estado de transição das moléculas substrato-produto, a enzima distorce a ligação (as ligações que definem a dobradura) dos substratos em sua forma no estado de transição, dessa forma reduzindo a quantidade de energia requerida para completar a transição).
- reduzindo a energia do estado de transição, mas sem distorcer o substrato, pela criação de um meio ambiente com a distribuição de carga oposta à do estado de transição.
-proporcionando uma via alternativa. Por exemplo, temporariamente reagindo com o substrato para formar um complexo ES intermediário, o qual seria impossível na ausência da enzima.
-reduzindo a reação de mudança de entropia por trazer os substrados juntos na orientação correta para reagirem. (Entropia é a fração de energia não disponível para a realização de um trabalho. A entropia ocorre na equação de energia de Gibbs (G): ∆G = ∆H + T∆S, onde ∆G é alteração na entalpia ou conteúdo de calor, T é temperatura absoluta e ∆S é alteração da entropia.) Considerando que o AG‡ sozinho se presta a este efeito.
Interessantemente, esse efeito entrópico envolve a desestabilização do estado de massa e sua contribuição para a catálise é relativamente pequena.
http://bioisolutions.blogspot.com/
As enzimas são biomoléculas catalisadoras. Quase todas são proteínas. Em reações enzimáticas, as moléculas no começo do processo, são chamadas substratos, e a enzima as converte em diferentes moléculas, os produtos. Quase todos os processos em uma célula biológica precisam de enzimas para ocorrer em taxas significativas. Sendo as enzimas seletivas para seus substratos e acelerando somente algumas reações de entre muitas possibilidades, o conjunto de enzimas produzido em uma célula determina quais ias metabólicas ocorrem naquela célula.
Como em todas as catálises, as enzimas trabalham por redução da ativação de energia (Ea ou ∆G‡) para uma reação, aumentando assim a taxa de reação. A maioria das taxas de reação enzimática é milhões de vezes mais rápida em comparação àquelas em reações não catalisadas. Entretanto, as enzimas diferem realmente da maioria dos outros catalizadores por serem muito mais específicas. As enzimas são conhecidas por catalisarem aproximadamente 4.000 reações. Algumas moléculas de RNA chamadas ribozimas catalisam reações, com o importante exemplo de serem alguma parte do ribossomo. Moléculas sintéticas chamadas enzimas artificiais também exibem catálise de tipo enzimática.
A atividade da enzima pode ser afetada por outras moléculas. Inibidores são moléculas que reduzem a atividade da enzima; ativadores são as que aumentam a atividade. Muidas drogas e remédios são inibidores de enzimas. A atividade também é afetada pela temperatura, meio-ambiente químico (e.g, pH), e a concentração do substrato. Algumas enzimas são usadas comercialmente, por exemplo, na síntese de antibióticos. Além disso, alguns produtos domésticos usam enzimas para acelerar reações bioquímicas e mecanismos. As enzimas são geralmente proteínas globulares (esféricas) e atingem de apenas 62 resíduos de aminoácidos de tamanho, como o monômero da tautomerase do oxalocronato 4, a mais de 2.500 resíduos na sintetase de ácido graxo. Um pequeno número de catálises biológicas baseadas em RNA existe, sendo as mais comuns no ribossomo; essas são referidas tanto como enzimas de RNA ou ribozimas. As atividades das enzimas são determinadas por sua estrutura tri-dimensional. Entretanto, embora a estrutura realmente determine a função, a previsão de uma nova atividade da enzima partindo-se apenas de sua estrutura é um problema muito difícil que ainda não foi solucionado.
A maioria das enzimas é muito maior que os substratos sobre os quais atua, e somente uma pequena porção da enzima (por volta de 3 a 4 aminoácidos) está diretamente envolvida na catálise. A região que contém esses resíduos catalíticos, liga-se ao substrato, e que conclui a reação é conhecida como sítio ativo. As enzimas também podem conter sítios que ligam co-fatores, os quais são necessários à catálise. Algumas enzimas também têm sítios de ligação para pequenas moléculas, as quais são frequentemente produtos ou substratos diretos ou indiretos da reação catalisada. Essa ligação pode servir para aumentar ou diminuir a atividade da enzima, proporcionando meios para regulação de retorno.
Como todas as proteínas, as enzimas são feitas da mesma forma, cadeias lineares de aminoácidos que se dobram para produzir um produto tri-dimensional. Cada única sequência de aminoácido produz uma estrutura específica, a qual tem propriedades únicas. Cadeias protéicas individuais podem, algumas vezes, agrupar-se formando um complexo proteico. A maioria das enzimas pode ser desnaturada, ou seja, desdobradas e inativadas, por desnaturadores químicos ou caloríficos, os quais rompem a estrutura tri-dimensional da proteína. Dependendo da enzima, a desnaturação pode ser reversível ou irreversível.
MECANISMOS
As enzimas podem atuar em várias vias, todas as quais abaixo de ΔG‡:
- reduzindo a ativação de energia através da criação de um meio ambiente no qual o estado de transição está estabilizado (ou seja, pressionado a forma de um substrato pela ligação da conformação do estado de transição das moléculas substrato-produto, a enzima distorce a ligação (as ligações que definem a dobradura) dos substratos em sua forma no estado de transição, dessa forma reduzindo a quantidade de energia requerida para completar a transição).
- reduzindo a energia do estado de transição, mas sem distorcer o substrato, pela criação de um meio ambiente com a distribuição de carga oposta à do estado de transição.
-proporcionando uma via alternativa. Por exemplo, temporariamente reagindo com o substrato para formar um complexo ES intermediário, o qual seria impossível na ausência da enzima.
-reduzindo a reação de mudança de entropia por trazer os substrados juntos na orientação correta para reagirem. (Entropia é a fração de energia não disponível para a realização de um trabalho. A entropia ocorre na equação de energia de Gibbs (G): ∆G = ∆H + T∆S, onde ∆G é alteração na entalpia ou conteúdo de calor, T é temperatura absoluta e ∆S é alteração da entropia.) Considerando que o AG‡ sozinho se presta a este efeito.
Interessantemente, esse efeito entrópico envolve a desestabilização do estado de massa e sua contribuição para a catálise é relativamente pequena.
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domingo, 12 de abril de 2009
Exposição do Lentivírus: expressão estável de anticorpos humanos na superfície de células humanas e partículas virais.
Ran Taube, Quan Zhue, ChenXu, Felipe Diaz-Griffero e outros.
Resumo:
Base de conhecimentos:
O isolamento de anticorpos humanos usando-se tecnologias disponíveis atualmente pode ser limitado pela restrição da expressão, dobramento e modificação de proteínas após a tradução. Nós descrevemos o descobrimento de uma plataforma que utiliza vetores lentivirais auto-inativadores (SIN) para a exibição da região variável da cadeia singular de alta afinidade (scFv) de fragmentos de anticorpos na superfície de células humanas e partículas virais.
Metodologia/principais achados:
As scFvFc (porção Fc e scFv) bivalentes de anticorpos humanos foram fundidas em estruturas com diferentes metades de ancoragem transmembrana (TM) para permitir a expressão eficiente e de alto nível em células humanas e a TM ótima foi identificada. A adição de um oitavo aminoácido no motivo de incorporação da gp41 do envelope do HIV-1 suplementou a expressão aumentada do scFvFc em células humanas e a incorporação às partículas lentivirais. Ambas as células humanas expondo anticorpos e as partículas virais ligaram-se ao antígeno especificamente (obs. o antígeno é a gp41. A gp41 com um aminoácido a mais foi introduzida através das partículas lentivirais.) A sulfatização dos resíduos de tirosina nos CDR (Receptor de conjunto de diferenciação? LIR?) uma propriedade recentemente mostrada por expandir a afinidade de ligação do anticorpo e o reconhecimento do antígeno também foi demonstrada. Altos níveis de expressão do scFvFc e a integração estável foi obtida em células humanas consequentemente à transdução com IRES contendo lentivetores bicistrônicos codificadores de ZsGreen (provavelmente a proteína fluorescente verde) quando a fusão protéica scFvFc era expressada a partir do primeiro cassete (fita codificadora). Um enriquecimento de mais de 106 vezes na expressão de anticorpos nas células foi atingido com uma rodada de pré-seleção de antígeno casada com pontaria magnética seguida por seleção/distribuição FACS. Finalmente, as células exibindo scFvFc puderam ser usadas diretamente em sondagens biológicas funcionais com extraordinária sensitividade.
Conclusões:
Esta plataforma de exposição de anticorpos complementará as tecnologias existentes em virtude de proporcionarem propriedades únicas para lentiviroses e expressão de anticorpos nas células humanas, aos quais, por sua vez, podem adicionar o descobrimento de novos mAbs terapêuticos.
Fonte: Lentivirus Display: Stable Expression of Human Antibodies on the Surface of Human Cells and Virus Particles
Ran Taube, Quan Zhue, ChenXu, Felipe Diaz-Griffero e outros.
Resumo:
Base de conhecimentos:
O isolamento de anticorpos humanos usando-se tecnologias disponíveis atualmente pode ser limitado pela restrição da expressão, dobramento e modificação de proteínas após a tradução. Nós descrevemos o descobrimento de uma plataforma que utiliza vetores lentivirais auto-inativadores (SIN) para a exibição da região variável da cadeia singular de alta afinidade (scFv) de fragmentos de anticorpos na superfície de células humanas e partículas virais.
Metodologia/principais achados:
As scFvFc (porção Fc e scFv) bivalentes de anticorpos humanos foram fundidas em estruturas com diferentes metades de ancoragem transmembrana (TM) para permitir a expressão eficiente e de alto nível em células humanas e a TM ótima foi identificada. A adição de um oitavo aminoácido no motivo de incorporação da gp41 do envelope do HIV-1 suplementou a expressão aumentada do scFvFc em células humanas e a incorporação às partículas lentivirais. Ambas as células humanas expondo anticorpos e as partículas virais ligaram-se ao antígeno especificamente (obs. o antígeno é a gp41. A gp41 com um aminoácido a mais foi introduzida através das partículas lentivirais.) A sulfatização dos resíduos de tirosina nos CDR (Receptor de conjunto de diferenciação? LIR?) uma propriedade recentemente mostrada por expandir a afinidade de ligação do anticorpo e o reconhecimento do antígeno também foi demonstrada. Altos níveis de expressão do scFvFc e a integração estável foi obtida em células humanas consequentemente à transdução com IRES contendo lentivetores bicistrônicos codificadores de ZsGreen (provavelmente a proteína fluorescente verde) quando a fusão protéica scFvFc era expressada a partir do primeiro cassete (fita codificadora). Um enriquecimento de mais de 106 vezes na expressão de anticorpos nas células foi atingido com uma rodada de pré-seleção de antígeno casada com pontaria magnética seguida por seleção/distribuição FACS. Finalmente, as células exibindo scFvFc puderam ser usadas diretamente em sondagens biológicas funcionais com extraordinária sensitividade.
Conclusões:
Esta plataforma de exposição de anticorpos complementará as tecnologias existentes em virtude de proporcionarem propriedades únicas para lentiviroses e expressão de anticorpos nas células humanas, aos quais, por sua vez, podem adicionar o descobrimento de novos mAbs terapêuticos.
Fonte: Lentivirus Display: Stable Expression of Human Antibodies on the Surface of Human Cells and Virus Particles
sábado, 4 de abril de 2009
601863 REGULATORY FACTOR X, 5; RFX5
Gene map locus 1q21.1-q21.3
TEXTO
As moléculas do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe II são glicoproteínas heterodiméricas transmembrana consistindo de cadeias alfa e delta. No homem, existem 3 isotipos (determinante antigênico (marcador) que ocorre em todos os membros de uma classe ou sub-classe nas cadeias pesadas de uma imunoglobulina ou no tipo e subtipo de cadeias leves de uma molécula de imunoglobulina. Acreditando-se que um determinante alotípico só ocorra numa sub-classe, um marcador antigênico isotípico numa sub-classe também pode ocorrer como marcador alotípico em outra classe. Alótipo é qualquer diferença antigênica geneticamente determinada dentro de uma classe de imunoglobulinas que ocorre entre membros de uma mesma espécie. – Eu entendi que isotipos são características iguais dentro de uma classe e alótipo são diferenças genéticas geradas dentro das subclasses. Se uma subclasse apresenta características iguais, essas mesmas poderiam se apresentar como características diferenciais em outras classes ou subclasses.) de MHC de classe II: HLA-DR, -DP e DQ. As moléculas do MHC de classe II atuam num papel chave no sistema imune. Elas apresentam peptídios antigênicos exógenos ao receptor dos linfócitos Th (T salvadores) CD4+, dessa forma disparando os eventos requeridos para a ativação antígeno-específica da célula T para a iniciação e sustentação das respostas imunes. Durand e outros (1997) notaram que o papel crucial no controle da resposta imune é exemplificad pelo achado de que níveis aberrativos ou ectópicos (fora do lugar) de expressão do MHC de classe II estão associados com doenças auto-imunes, enquanto a falta da expressão do MHC de classe II resulta na severa síndrome de imunodeficiência chamada deficiência do MHC de classe II, ou a síndrome dos linfócitos descobertos de tipo II (BLS;209920).Ao menos 4 grupos de complementação têm sido identificados em linhas de células B estabelecidos a partir de pacientes com BLS. O defeito molecular responsável pelo grupo de complementação A residem no gene codificador de CIITA (MHC2TA; 60005). CIITA é um transativador não ligante de DNA que funciona como um interruptor molecular controlando ambos o tipo celular específico e o gene de transcrição indutível do MHC de classe II. Em contraste, os defeitos nos grupos de complementação B, C e D todos levam à deficiência no RFX, um complexo de proteínas nucleares que liga-se ao Box X dos promotores do MHC de classe II (veja RFX2; 142765). A falta de atividade de ligação do RFX no grupo de complementação C resulta de mutações no gene codificador da sub-unidade de 75 quilo-dáltons do RFX (Steimle e outros, 1995). Esse gene foi chamado RFX5 pois ele é o quinto membro da família crescente de proteínas de ligação a DNA que compartilham um novo e altamente caracterizado domínio de ligação a DNA chamado motivo RFX.
Dois dos genes defeituosos nos grupos de complementação 5 identificados na síndrome dos lifócitos despidos negativos para a classe II ou em mutantes correspondentes em laboratório têm sido clonados (Mach e outros, 1996). Um gene codifica o RFX5; o outro, o MHV2TA (CIITA), codifica uma grande proteína com um domínio de ativação transcricional ácido (acidificado). A última proteína não interage com o DNA. Scholl e outros (1997) demonstraram que o RFX5 pode ativar a transcrição somente em cooperação com CIITA. RFX5 e CIITA associam-se para formar um complexo capaz de ativar a transcrição a partir dos promotores do MHC de classe II. Neste complexo, a especificidade do promotor é determinada pelo domínio de ligação ao DNA de RFX5 e o aparato geral de transcrição é recrutado pela ativação do domínio acidificado de CIITA.
Nekrep e outros (2000) demonstraram uma interação direta entre o terminal C de RFXAP (601861) e RFXANK (603200); proteínas RFXAP ou RFXANK mutantes falharam e ligarem-se. Os autores descobriram que a RFX5 liga-se somente à estrutura RFXANK-RFXAP e não a cada proteína sozinha. Entretanto, nem a estrutrura nem o RFX5 sozinhos podem ligar-se ao DNA. Nekrep e outros (2000) concluíram que a ligação da estrutura RFXANK-RFXAP ao RFX5 leva à uma alteração na conformação nos últimos que expõe o domínio de ligação a DNA do RFX5. O domínio de ligação a DNA de RFX5 ancora o complexo RFX aos boxes dos promotores X e X do MHC de classe II. Outra parte da proteína RFX5 interage com o MHC2TA. Os autores ressaltaram que a mutação de cada proteína no grupo de complementação B ou no grupo D de pacientes BLS impede sua ligação a outra proteína, explicando que os promotores do MHC de classe II estão desprotegidos na síndrome do linfócito desprotegido (descoberto).
Emery e outros (1996) revisaram o RFX1, RFX5, e outros membros da família RFX das proteínas de ligação a DNA.
Villar e outros (1997) mapearam o gene RFX5 no cromossomo 1q21 por hibridização de fluorescência em sítio.
Villard e outros (1997) caracterizaram as mutações em quatro pacientes com deficiência no MHC de classe II conhecidas por abrigaram um defeito no gene RFX5.
Hospedeiros e patógenos envolvem várias respostas para controlar a infecção e evadir a destruição, respectivamente. Usando cromatografia de colunas, Zhong e outros (2001) identificaram um fator na Chlamydia trachomatis, o organismo causador do tracoma (inflamação microbiana crônica contagiosa, cin hipertrofia conjuntiva, caracterizada pela formação de pequenos grânulos translúcidos acinzentados ou amarelados) e da infecção urogenital crônica, que degrada os fatores de transcrição RFX5 e USF1 (191523). A degradação desses fatores correlaciona-se com a supressão da expressão antigênica do MHC de classe I e de classe II em células infectadas, dessa forma suprimindo a resposta imune do hospedeiro.
Nekrep e outros (2002) identificaram uma mutação de arginina 149 para glutamina (R149Q; 601863.0005) no domínio de ligação ao DNA de RFX5 (resíduos de 92 a 168) em linhas de células (chamadas linhas de células “Ker”) derivadas de gêmeos histo-idênticos carentes da transcrição do MHC de classe II relatados por Wolf e outros (1995) e Douhan e outros (1996). Análises de molelação funcional e estrutural indicaram que a proteína mutante era incapaz de ligar-se o box X do promotor do HLA-DRA (142860), enquanto a expressão do RFX5 de tipo selvagem nas linhas de células Ker recuperaram a expressão do MHC de classe II.
FONTE:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=601863
Gene map locus 1q21.1-q21.3
TEXTO
As moléculas do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe II são glicoproteínas heterodiméricas transmembrana consistindo de cadeias alfa e delta. No homem, existem 3 isotipos (determinante antigênico (marcador) que ocorre em todos os membros de uma classe ou sub-classe nas cadeias pesadas de uma imunoglobulina ou no tipo e subtipo de cadeias leves de uma molécula de imunoglobulina. Acreditando-se que um determinante alotípico só ocorra numa sub-classe, um marcador antigênico isotípico numa sub-classe também pode ocorrer como marcador alotípico em outra classe. Alótipo é qualquer diferença antigênica geneticamente determinada dentro de uma classe de imunoglobulinas que ocorre entre membros de uma mesma espécie. – Eu entendi que isotipos são características iguais dentro de uma classe e alótipo são diferenças genéticas geradas dentro das subclasses. Se uma subclasse apresenta características iguais, essas mesmas poderiam se apresentar como características diferenciais em outras classes ou subclasses.) de MHC de classe II: HLA-DR, -DP e DQ. As moléculas do MHC de classe II atuam num papel chave no sistema imune. Elas apresentam peptídios antigênicos exógenos ao receptor dos linfócitos Th (T salvadores) CD4+, dessa forma disparando os eventos requeridos para a ativação antígeno-específica da célula T para a iniciação e sustentação das respostas imunes. Durand e outros (1997) notaram que o papel crucial no controle da resposta imune é exemplificad pelo achado de que níveis aberrativos ou ectópicos (fora do lugar) de expressão do MHC de classe II estão associados com doenças auto-imunes, enquanto a falta da expressão do MHC de classe II resulta na severa síndrome de imunodeficiência chamada deficiência do MHC de classe II, ou a síndrome dos linfócitos descobertos de tipo II (BLS;209920).Ao menos 4 grupos de complementação têm sido identificados em linhas de células B estabelecidos a partir de pacientes com BLS. O defeito molecular responsável pelo grupo de complementação A residem no gene codificador de CIITA (MHC2TA; 60005). CIITA é um transativador não ligante de DNA que funciona como um interruptor molecular controlando ambos o tipo celular específico e o gene de transcrição indutível do MHC de classe II. Em contraste, os defeitos nos grupos de complementação B, C e D todos levam à deficiência no RFX, um complexo de proteínas nucleares que liga-se ao Box X dos promotores do MHC de classe II (veja RFX2; 142765). A falta de atividade de ligação do RFX no grupo de complementação C resulta de mutações no gene codificador da sub-unidade de 75 quilo-dáltons do RFX (Steimle e outros, 1995). Esse gene foi chamado RFX5 pois ele é o quinto membro da família crescente de proteínas de ligação a DNA que compartilham um novo e altamente caracterizado domínio de ligação a DNA chamado motivo RFX.
Dois dos genes defeituosos nos grupos de complementação 5 identificados na síndrome dos lifócitos despidos negativos para a classe II ou em mutantes correspondentes em laboratório têm sido clonados (Mach e outros, 1996). Um gene codifica o RFX5; o outro, o MHV2TA (CIITA), codifica uma grande proteína com um domínio de ativação transcricional ácido (acidificado). A última proteína não interage com o DNA. Scholl e outros (1997) demonstraram que o RFX5 pode ativar a transcrição somente em cooperação com CIITA. RFX5 e CIITA associam-se para formar um complexo capaz de ativar a transcrição a partir dos promotores do MHC de classe II. Neste complexo, a especificidade do promotor é determinada pelo domínio de ligação ao DNA de RFX5 e o aparato geral de transcrição é recrutado pela ativação do domínio acidificado de CIITA.
Nekrep e outros (2000) demonstraram uma interação direta entre o terminal C de RFXAP (601861) e RFXANK (603200); proteínas RFXAP ou RFXANK mutantes falharam e ligarem-se. Os autores descobriram que a RFX5 liga-se somente à estrutura RFXANK-RFXAP e não a cada proteína sozinha. Entretanto, nem a estrutrura nem o RFX5 sozinhos podem ligar-se ao DNA. Nekrep e outros (2000) concluíram que a ligação da estrutura RFXANK-RFXAP ao RFX5 leva à uma alteração na conformação nos últimos que expõe o domínio de ligação a DNA do RFX5. O domínio de ligação a DNA de RFX5 ancora o complexo RFX aos boxes dos promotores X e X do MHC de classe II. Outra parte da proteína RFX5 interage com o MHC2TA. Os autores ressaltaram que a mutação de cada proteína no grupo de complementação B ou no grupo D de pacientes BLS impede sua ligação a outra proteína, explicando que os promotores do MHC de classe II estão desprotegidos na síndrome do linfócito desprotegido (descoberto).
Emery e outros (1996) revisaram o RFX1, RFX5, e outros membros da família RFX das proteínas de ligação a DNA.
Villar e outros (1997) mapearam o gene RFX5 no cromossomo 1q21 por hibridização de fluorescência em sítio.
Villard e outros (1997) caracterizaram as mutações em quatro pacientes com deficiência no MHC de classe II conhecidas por abrigaram um defeito no gene RFX5.
Hospedeiros e patógenos envolvem várias respostas para controlar a infecção e evadir a destruição, respectivamente. Usando cromatografia de colunas, Zhong e outros (2001) identificaram um fator na Chlamydia trachomatis, o organismo causador do tracoma (inflamação microbiana crônica contagiosa, cin hipertrofia conjuntiva, caracterizada pela formação de pequenos grânulos translúcidos acinzentados ou amarelados) e da infecção urogenital crônica, que degrada os fatores de transcrição RFX5 e USF1 (191523). A degradação desses fatores correlaciona-se com a supressão da expressão antigênica do MHC de classe I e de classe II em células infectadas, dessa forma suprimindo a resposta imune do hospedeiro.
Nekrep e outros (2002) identificaram uma mutação de arginina 149 para glutamina (R149Q; 601863.0005) no domínio de ligação ao DNA de RFX5 (resíduos de 92 a 168) em linhas de células (chamadas linhas de células “Ker”) derivadas de gêmeos histo-idênticos carentes da transcrição do MHC de classe II relatados por Wolf e outros (1995) e Douhan e outros (1996). Análises de molelação funcional e estrutural indicaram que a proteína mutante era incapaz de ligar-se o box X do promotor do HLA-DRA (142860), enquanto a expressão do RFX5 de tipo selvagem nas linhas de células Ker recuperaram a expressão do MHC de classe II.
FONTE:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=601863
quinta-feira, 2 de abril de 2009
Lectina ligante de Manose ; LMAN1
ERGIC53
Gene map locus 18q21.3-q22
TEXTO
A MR60 é uma lectina específica de manose identificada em compartimentos intracelulares de células HL60. A MR60 é idêntica à ERGIC53, uma proteína marcadora do compartimento intermediário que vém e vai entre o retículo endoplasmático (ER) e o aparato cis-Golgi cujo cDNA foi clonado por Schindler e outros (1993). A proteína ERGIC53 tem uma massa molecular calculada em 54 quilo-dáltons e contém uma sequência sinal no terminal N, um segmento transmembrana, e um curto dom´nio citoplasmático com um motivo de retenção do ER.
A MR60 é uma lectina específica de manose identificada em compartimentos intra-celulares de células HL60. A MR60 é idêntica a ERGIC53, um marcador de proteína do compartimento intermediário alternante (que faz vai-e-vém) entre o retículo endoplasmático e o aparato Golgi cis cujo cDNA foi clonado por Schindler e outros (1993). A proteína ERGIC53 de 510 aminoácidos tem uma massa molecular calculada de 54 quilo-dáltons e contém uma sequência sinal no terminal N, um segmento transmembrana, e um domínio citoplasmático curto com um motivo de retenção do reticulo endoplasmático.
Neve e outros (2003) descobriram que os domínios de reconhecimento de carbohidrato no terminal N de ERGIC53, VIPL (LMAN2L;609552) e VIP36 (LMAN2;609551) são altamente conservados, particularmente os motivos requeridos para ligação de Ca(2+) e manose e as duas cisteínas pressupostas por serem ligadas por dissulfato. As três proteínas têm motivos de retenção (recuperação) do ER no terminal C. Análises de Northern Blot detectaram transcritos de ERGIC53 de 6,0 e 2,3 quilobases em todos os tecidos examinados, com expressão mais alta no músculo esquelético, rins, fígado e placenta.
FUNÇÃO DO GENE
Os achados de Nichols e outros (1998) de que mutações em ERGIC53 causam deficiência combinada dos fatores V e VIII (F5F8D;227300) (veja Genética Molecular) sugeriram que a ERGIC53 pode funcionar como uma acompanhante (chaperone) molecular para o transporte do ER para o Golgi de um sub-conjunto de proteínas secretadas, incluindo os fatores V e VIII.
Nichols e Ginsburg (1999) estabeleceram que a identificação do ERGIC53 como um componente da maquinaria de transporte do ER para o Golgi que é requerida para a exportação eficiente dos fatores V e VIII foi a primeira demonstração de uma via específica de carregamento para a exportação de proteínas do ER nas células de mamíferos. Entretanto, os níveis aparentemente normais observados em pacientes F5F8D para a maioria de outras proteínas do plasma demonstrou que a ERGIC53 não é essencial para a integridade do compartimento intermediário ou o processo mais geral de exportação de proteínas. Nichols e Ginsburg (1999) sugeriram que a identificação de um defeito genético no sub-conjunto de pacientes com F5F8D mas com ERGIC53 intacta pode desmascarar componentes críticos dessa via de transporte única.
Proteínas corretamente dobradas destinadas à secreção são empacotadas no retículo endoplasmático para dentro de vesículas revestidas de COPII (Schekman e Orci, 1996), as quais subsequentemente fundem-se para formar o compartimento intermediário retículo-Golgi (ERGIC). Um mecanismo alternativo envolve o empacotamento seletivo de proteínas secretadas com a ajuda de receptores de carga específicos. O último modelo seria consistente com mutações na LMAN1 causando um bloqueio seletivo na exportação dos fatores V e VIII.
Aproximadamente 30% dos indivíduos com F5F8D tem níveis normais de LMAN1, sugerindo que mutações em outro gene também podem estar associadas à F5F8D. Zhang e outros (2003) mostraram que mutações inativadoras do gene MCFD2 (607788) causam F5F8D com um fenótipo indistinguível daquele causado por mutações na LMAN1. A MCFD2 está localizada no ERGIC (compartimento intermediário entre o RE e o Golgi) através de uma interação direta dependente de cálcio com LMAN1. Esses achados sugeriram que um complexo de MCFD2 e LMAN1 formam um receptor de carga específica para o transporte do retículo endoplasmático para o Golgi de proteínas selecionadas, incluindo os fatores V e VIII.
MAPEAMENTO
Arar e outros (1996) mapearam o gene LMAN1 por hibridização isotópica em sítio no 18q21.3-q22.
GENÉTICA MOLECULAR
Nichols e outros (1998) mapearam o gene de LMAN1 em uma YAC (cromossomos artificiais de levedura) e BAC contígua contendo uma região crítica para a deficiência combinada dos fatores V e VIII, uma desordem de sangramento autossômica (que não é dos cromossomos sexuais) recessiva. Análises de sequência de DNA identificaram duas mutações diferentes, contando com todos os indivíduos afetados em nove famílias estudadas.
Análises de imuno-fluorescência e Western de linfócitos imortalizados de pacientes homozgotos para ambas as duas mutações demonstraram completa falta de expressão do gene mutado nessas células. Esses achados sugerem que a ERGIC53 pode funcionar como uma acompanhante (chaperone) molecular para o transporte do RE para o Golgi de um sub-conjunto específico de proteínas secretadas, incluindo os fatores V e VIII.
Neerman-Arbez e outros (1999) desempenharam análises de sequência e SSCP do gene ERGIC53 em 35 famílias com F5F8D de diferentes origens étinicas. Eles identificaram 13 mutações distintas representando 52 dos 70 alelos mutantes. Essas mutações eram 3 sítios de splicing, 6 inserções e deleções resultado em sequências sem sentido de tradução, 3 códons sem sentido, e a eliminação de um códon de iniciação de tradução. Essas mutações foram presumidas como resultantes na síntese de proteínas truncadas ou nenhum produto protéico. O estudo revelou que a deficiência combinada do F5 e do F8 apresenta extensiva heterogeneidade alélica e que todas as mutações em ERGIC53 que resultam em F5F8D são nulas. Aproximadamente 26% das mutações não têm sido identificadas, sugerindo que lesões em elementos regulatórios ou anormalidades severas dentro dos íntrons podem ser responsáveis pela doença nesses indivíduos. Em duas famílias assim, Neerman-Arbez e outros (1999) descobriram que a proteína ERGIC53 era detectável em níveis normais nos linfócitos dos pacientes, levantando a possibilidade adicional de defeitos em outros lócus genéticos.
Nichols e outros (1999) analisaram 19 famílias adicionais por análise direta da sequência da região codificadora inteira e das junções intron/éxon do gene ERGIC53. Sete novas mutações foram identificadas em 10 famílias, com uma família adicional encontrada abrigando uma das duas mutações previamente descritas. Todas as mutações identificadas seriam pressupostas por resultarem na completa ausência da proteína ERGIC53 funcional. Em 8 das 19 famílias, nenhuma mutação foi identificada. Dados de genotipagem indicaram que ao menos 2 dessas famílias não estavam ligadas ao lócus do ERGIC53. Esses resultados, como aqueles de Neerman-Arbez e outros (1999), sugeriram que um sub-conjunto significante da deficiência combinada dos fatores V e VIII é devido a mutações em um ou mais genes adicionais.
Zhang e outros (2003) mostraram que mutações de inativação no gene MCFD2 (607788) causam a F5F8D com um fenótipo indistinto daquela causada por mutações na LMAN1.
{OBS.: A LMAN1 liga-se a manoses encontradas em leguminosas.}
FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=601567
ERGIC53
Gene map locus 18q21.3-q22
TEXTO
A MR60 é uma lectina específica de manose identificada em compartimentos intracelulares de células HL60. A MR60 é idêntica à ERGIC53, uma proteína marcadora do compartimento intermediário que vém e vai entre o retículo endoplasmático (ER) e o aparato cis-Golgi cujo cDNA foi clonado por Schindler e outros (1993). A proteína ERGIC53 tem uma massa molecular calculada em 54 quilo-dáltons e contém uma sequência sinal no terminal N, um segmento transmembrana, e um curto dom´nio citoplasmático com um motivo de retenção do ER.
A MR60 é uma lectina específica de manose identificada em compartimentos intra-celulares de células HL60. A MR60 é idêntica a ERGIC53, um marcador de proteína do compartimento intermediário alternante (que faz vai-e-vém) entre o retículo endoplasmático e o aparato Golgi cis cujo cDNA foi clonado por Schindler e outros (1993). A proteína ERGIC53 de 510 aminoácidos tem uma massa molecular calculada de 54 quilo-dáltons e contém uma sequência sinal no terminal N, um segmento transmembrana, e um domínio citoplasmático curto com um motivo de retenção do reticulo endoplasmático.
Neve e outros (2003) descobriram que os domínios de reconhecimento de carbohidrato no terminal N de ERGIC53, VIPL (LMAN2L;609552) e VIP36 (LMAN2;609551) são altamente conservados, particularmente os motivos requeridos para ligação de Ca(2+) e manose e as duas cisteínas pressupostas por serem ligadas por dissulfato. As três proteínas têm motivos de retenção (recuperação) do ER no terminal C. Análises de Northern Blot detectaram transcritos de ERGIC53 de 6,0 e 2,3 quilobases em todos os tecidos examinados, com expressão mais alta no músculo esquelético, rins, fígado e placenta.
FUNÇÃO DO GENE
Os achados de Nichols e outros (1998) de que mutações em ERGIC53 causam deficiência combinada dos fatores V e VIII (F5F8D;227300) (veja Genética Molecular) sugeriram que a ERGIC53 pode funcionar como uma acompanhante (chaperone) molecular para o transporte do ER para o Golgi de um sub-conjunto de proteínas secretadas, incluindo os fatores V e VIII.
Nichols e Ginsburg (1999) estabeleceram que a identificação do ERGIC53 como um componente da maquinaria de transporte do ER para o Golgi que é requerida para a exportação eficiente dos fatores V e VIII foi a primeira demonstração de uma via específica de carregamento para a exportação de proteínas do ER nas células de mamíferos. Entretanto, os níveis aparentemente normais observados em pacientes F5F8D para a maioria de outras proteínas do plasma demonstrou que a ERGIC53 não é essencial para a integridade do compartimento intermediário ou o processo mais geral de exportação de proteínas. Nichols e Ginsburg (1999) sugeriram que a identificação de um defeito genético no sub-conjunto de pacientes com F5F8D mas com ERGIC53 intacta pode desmascarar componentes críticos dessa via de transporte única.
Proteínas corretamente dobradas destinadas à secreção são empacotadas no retículo endoplasmático para dentro de vesículas revestidas de COPII (Schekman e Orci, 1996), as quais subsequentemente fundem-se para formar o compartimento intermediário retículo-Golgi (ERGIC). Um mecanismo alternativo envolve o empacotamento seletivo de proteínas secretadas com a ajuda de receptores de carga específicos. O último modelo seria consistente com mutações na LMAN1 causando um bloqueio seletivo na exportação dos fatores V e VIII.
Aproximadamente 30% dos indivíduos com F5F8D tem níveis normais de LMAN1, sugerindo que mutações em outro gene também podem estar associadas à F5F8D. Zhang e outros (2003) mostraram que mutações inativadoras do gene MCFD2 (607788) causam F5F8D com um fenótipo indistinguível daquele causado por mutações na LMAN1. A MCFD2 está localizada no ERGIC (compartimento intermediário entre o RE e o Golgi) através de uma interação direta dependente de cálcio com LMAN1. Esses achados sugeriram que um complexo de MCFD2 e LMAN1 formam um receptor de carga específica para o transporte do retículo endoplasmático para o Golgi de proteínas selecionadas, incluindo os fatores V e VIII.
MAPEAMENTO
Arar e outros (1996) mapearam o gene LMAN1 por hibridização isotópica em sítio no 18q21.3-q22.
GENÉTICA MOLECULAR
Nichols e outros (1998) mapearam o gene de LMAN1 em uma YAC (cromossomos artificiais de levedura) e BAC contígua contendo uma região crítica para a deficiência combinada dos fatores V e VIII, uma desordem de sangramento autossômica (que não é dos cromossomos sexuais) recessiva. Análises de sequência de DNA identificaram duas mutações diferentes, contando com todos os indivíduos afetados em nove famílias estudadas.
Análises de imuno-fluorescência e Western de linfócitos imortalizados de pacientes homozgotos para ambas as duas mutações demonstraram completa falta de expressão do gene mutado nessas células. Esses achados sugerem que a ERGIC53 pode funcionar como uma acompanhante (chaperone) molecular para o transporte do RE para o Golgi de um sub-conjunto específico de proteínas secretadas, incluindo os fatores V e VIII.
Neerman-Arbez e outros (1999) desempenharam análises de sequência e SSCP do gene ERGIC53 em 35 famílias com F5F8D de diferentes origens étinicas. Eles identificaram 13 mutações distintas representando 52 dos 70 alelos mutantes. Essas mutações eram 3 sítios de splicing, 6 inserções e deleções resultado em sequências sem sentido de tradução, 3 códons sem sentido, e a eliminação de um códon de iniciação de tradução. Essas mutações foram presumidas como resultantes na síntese de proteínas truncadas ou nenhum produto protéico. O estudo revelou que a deficiência combinada do F5 e do F8 apresenta extensiva heterogeneidade alélica e que todas as mutações em ERGIC53 que resultam em F5F8D são nulas. Aproximadamente 26% das mutações não têm sido identificadas, sugerindo que lesões em elementos regulatórios ou anormalidades severas dentro dos íntrons podem ser responsáveis pela doença nesses indivíduos. Em duas famílias assim, Neerman-Arbez e outros (1999) descobriram que a proteína ERGIC53 era detectável em níveis normais nos linfócitos dos pacientes, levantando a possibilidade adicional de defeitos em outros lócus genéticos.
Nichols e outros (1999) analisaram 19 famílias adicionais por análise direta da sequência da região codificadora inteira e das junções intron/éxon do gene ERGIC53. Sete novas mutações foram identificadas em 10 famílias, com uma família adicional encontrada abrigando uma das duas mutações previamente descritas. Todas as mutações identificadas seriam pressupostas por resultarem na completa ausência da proteína ERGIC53 funcional. Em 8 das 19 famílias, nenhuma mutação foi identificada. Dados de genotipagem indicaram que ao menos 2 dessas famílias não estavam ligadas ao lócus do ERGIC53. Esses resultados, como aqueles de Neerman-Arbez e outros (1999), sugeriram que um sub-conjunto significante da deficiência combinada dos fatores V e VIII é devido a mutações em um ou mais genes adicionais.
Zhang e outros (2003) mostraram que mutações de inativação no gene MCFD2 (607788) causam a F5F8D com um fenótipo indistinto daquela causada por mutações na LMAN1.
{OBS.: A LMAN1 liga-se a manoses encontradas em leguminosas.}
FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=601567
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