REVIGORAÇÃO DE CÉLULAS t ESPECÍFICAS PARA O HIV EXAUSTAS, POR MEIO DO BLOQUEIO DE LIGANTES PD-1-PD-1
Gordon J. Freeman, E. John Wherry, Rafi Ahmed, e Arlene H. Sharpe

A morte programada (PD)-1-PD-1 pela via do ligante (PD-L), a qual é parte da família B7-CD28, consiste do receptor de PD-1 e de seus ligantes PD-L1 e PD-L2. O casamento do PD-1 com seus ligantes inibe as respostas imunes, e um trabalho recente demonstra que o PD-1 é altamente expressivo em células T exauridas durante a coriomeningite linfocítica crônica viral (LCMV) em camundongos infectados. O bloqueio dessa via revigora as células T exaustas, permitindo sua expansão e produção de citocinas efetoras, levantando a questão sobre se este caminho tem sido explorado por uma variedade de viroses durante a infecção crônica. Novos estudos agora estendem essas observações para a infecção por HIV e doenças humanas.

EXPRESSÃO DE PD-1 E SINALIZAÇÃO

PD-1 foi isolado como um gene sobre-regulado (regulado para mais) em uma célula T de hibridoma [tumor de células híbridas utilizado na produção “in vitro” de anticorpos monoclonais específicos; produzido pela fusão de uma linhagem de cultura tecidual estabelecida de células tumorais linfocitárias (p.ex. células do plasmocitoma de camundongos) e células produtoras de anticorpos específicos (p. ex. espemócitos de camundongos especificamente imunizados); as fusões são obtidas com o uso de polietilenoglicol ou outros métodos. Dic.Stedman] sofrendo morte celular por apoptose. PD-1 (CD279) é expressada por indução em células TCD4, TCD8, NKT, células B, monócitos no momento de ativação . Esta ampla expressão de PD-1 contrasta com a supressão de CD28 e CTLA-4 em células específicas. [CTLA4 é um membro da superfamília de imunoglobulinas e é uma molécula co-estimuladora expressada por células T ativadas. CTLA4 é similar ao co-estimulador de células T CD28, e ambas moléculas ligam B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86) em células apresentado antígenos. CTLA4 transmite um sinal inibitório para as células T, enquanto CD28 transmite um sinal estimulador em células T específicas. (OMIM 123890)]. PD-1 transduz (conduz um sinal energético) um sinal quando engatada em combinação com ligação de receptor da família CD28. O domínio citoplasmático de PD-1 contém dois motivos de sinalização de tirosina ambos os quais podem ser fosforilados sobre a combinação com o receptor. A fosforilação da segunda tirosina, um imuno-receptor com motivo de interruptor baseado em tirosina, recruta a tirosina fosfatase SHP-2 e em menor volume SHP-1 para o domínio ctoplasmático de PD-1. [SMALL HETERODIMER PARTNER; SHP; SHP1 – a superfamília de receptores nucleares é um grupo de fatores de transcrição regulada por pequenos hormônio hidrofóbicos como os ácidos retinóicos, hormônio da tiróide e esteróides. Essa superfamília também inclui receptores nucleares órfãos, como NR0B2, os quais são proteínas relatadas que não tem ligantes conhecidos(OMIM 604630)] O recrutamento dessas fosfatases leva à desfosforilação do TCR próximo sinalizando moléculas, inclusive ZAP70, PKCθ e CD3’ζ , levando à atenuação do sinal TCR/CD28. A sinalização de PD-1 impede a ativação de quinases 3 fosfatidilinositol mediada por CD28, resultando em redução da fosforilação de AKT e do metabolismo da glicose.

EXPRESSÃO DE LIGANTES DE PD-1

Os ligantes de PD-1 têm padrões distintos de expressão. PD-L2 (B7-DC; CD273) é expressada por indução somente em células apresentadoras de antígenos profissionais e não profissionais. PD-L1 é constitutivamente expressada em células B, células dendríticas, macrófagos e células T, e é mais sobre-regulada na ativação. PD-L1 também é expressada em uma ampla variedade de tipos de células não hematopoiéticas, incluindo células do endotélio vascular, células do epitélio tubular renal, miocárdio cardíaco, células de ilhas pancreáticas, células gliais no cérebro(glia=neuroglia: neuróglia são elementos celulares não-neuronais dos sistemas nervoso central e periférico; estão invariavelmente interpostas entre os neurônios e os vasos sangüíneos que suprem o sistema nervoso. Dic.Stedman), músculo inflamado e queratinócitos (células da epiderme e do epitélio oral). Os interferons α,β e y (alfa, beta e gama) são poderosamente sobre-reguladores da expressão de PD-L1 em células apresentadoras de antígenos, células do endotélio e células epiteliais. Durante as respostas pró-inflamatórias imunes, tal como infecção e rejeição a transplantes, a expressão de PD-L1 é intensa e extensiva. Por exemplo, PD-L1 é expressada nas células de Kupffer do fígado e é sobre-regulada (regulada para mais) em hepatócitos após a infecção por hepatite B. PD-L1 também é expressada em sítios de privilégio imune tal como a placenta e os olhos. A expressão de PD-1 é encontrada em muitos tumores sólidos, e alta expressão de PD-L1 está associada com pobre prognóstico.

A EXAUSÃO VIRAL E A VIA DE PD-1-PD-L.

Células T CD8 antivirais efetoras possuem variadas propriedades funcionais incluindo a produção de citocina (e.g., IFN-y, TNF-α, IL-2), com potencial citotóxico (e.g., exocitose[processo pelo qual são liberados grânulos ou gotículas secretoras de uma célula; a membrana ao redor do grânulo se funde com a membrana celular, que se rompe, e a secreção é liberada. Dic Stedman]dos grânulos de perforina e granzime [perforina é uma proteína encontrada nos grânulos citoplasmáticos de linfócitos T citotóxicos e das células exterminadoras naturais (células natural killer). Esta proteína está envolvida na lise de células-alvo pelas células NK]{granzime= protease com atividade serina esterase que representa a maior parte do conteúdo dos grânulos das células T citotóxicas. Não se sabe de as células T citotóxicas precisam dessas enzimas para matar. Dic.Stedman}, alto potencial proliferativo, baixa apoptose, e para células de memória, a habilidade de auto-regeneração por via de retorno homeostático. Um dos fatores-chave de células TCD8 de memória é a habilidade para rapidamente reativar múltiplas funções efetoras e promover vigorosa proliferação após a re-exposição ao antígeno. Em contraste com a alta capacidade funcional de células TCD8 efetoras e de memória após aguda infecção ou vacinação, a função de células TCD8 é muitas vezes reduzida ou exaurida durante infecções crônicas. A exaustão foi originalmente descrita durante infecção crônica por LCMV como a persistência de células TCD8 vírus-específicas sem funções efetoras. A exaustão de células TCD8 pareceu ser uma notória característica não somente de infecções crônicas experimentais em camundongos, mas também durante infecções crônicas em primatas e humanos. Por exemplo, células TCD8 antígeno-específicas não funcionais têm sido observadas durante a infecção por SIV em primatas e infecção por HIV, hepatite B, hepatite C em humanos e no vírus linfotrópico T humano de tipo 1 (vírus com tropismo para linfócitos T humanos).
Estudos de ambos modelos de infecção crônica no camundongo e em humanos tem demonstrado que a exaustão compreende uma gama de disfunções de relativamente médias ao extremo. Potencial proliferativo reduzido é uma característica chave de exaustão que freqüentemente ocorre quando outras funções tais como produção de citocinas estão em grande parte intactas. De fato, o alto potencial proliferativo correlaciona-se com a não progressão durante a infecção por HIV e pode ser uma propriedade decisiva para aquelas células T que podem responder à intervenção terapêutica. Nesse ponto parece haver uma distinta hierarquia de exaustão com certas propriedades funcionais, tal como produção de IL-2 e potencial proliferativo, as quais são perdidas primeiro, e outras funções, como produção de IFN-y, que são mais resistentes `a inativação. A duração da infecção, nível de exposição ao antígeno, e a avaliabilidade de células TCD4 salvadoras (helper) são fatores cruciais que afetam o nível de exaustão durante uma dada infecção crônica.
O tipo e a qualidade das APC (células apresentadoras de antígeno) também pode mudar dramaticamente durante infecções crônicas como, por exemplo, APCs profissionas são mortas e os sinais inflamatórios mudam. É plausível que esse repertório de APCs alteradas e mudanças associadas à co-estimulação venham influenciar a exaustão das células T durante as infecções crônicas. Durante a infecção por HIV, a expressão superficial de PD-L1 em células apresentadoras de antígenos é aumentada e a expressão de CD86 (B7-2) é diminuída, tipificando o balanço entre sinais inibidores e estimuladores entregues às células T em favor da inibição. Adicionalmente, os sinais inibitórios entregues por PD-L1 em células epiteliais e endoteliais podem assumir/aceitar significância adicional quando APCs profissionais são reduzidas durante a infecção crônica.
Estudos recentes têm mostrado que PD-1 é altamente expressada por células TCD8 durante a infecção crônica por LCMV e que o caminho PD-1-PD-L exerce um papel principal na regulação da exaustão de células T durante esta infecção. Quand anticorpos foram usados para bloquar o caminho PD-1-PD-L “in vivo” durante a infecção crônica por LCMV, as respostas de células TCD8 vírus-específicas foram potencialmente aumentadas. Não somente foi o número de células TCD8 específicas para LCMV que expandiu dramaticamente, mas suas funções também foram aperfeiçoadas. Após o bloqueio PD-1-PD-l “in vivo”, as células TCD8 vírus-específicas produziram mais IFN-y e TNF-α em uma base por célula. A conseqüência dessa exaustão de células TCD8 vírus-específica revertida foi uma considerável redução na carga viral. Este estudo preparou o estágio para investigação sobre a expressão de PD-1 e o possível controle da exaustão de células T pelo caminho da PD-1-PD-L, durante a infecção viral crônica humana.

A VIA PD-1-PD-L NA INFECÇÃO POR HIV

Varios estudos novos sugerem um papel para a via PD-1-PD-L em células TCD8 vírus-específicas examinadas durante a infecção por HIV. O estudo por Petrovas e outros sobre este tema, e estudos de Day e outros e Trautmann e outros publicados recentemente no Nature e Nature Medicine respectivamente, demonstraram que a expressão de PD-1 é elevada em células TCD8 específicas para o HIV e que o bloqueio da via PD-1-PD-L leva ao aumento da proliferação de células T e da produção de citocinas efetoras. Trabalhos prévios demonstraram que PD-L1 é sobre-regulada na infecção por HIV. Coletivamente, essas observações sugerem que a via PD-1-PD-L pode realmente ser operante durante a infecção crônica por HIV.
Uma grande porcentagem de células TCD8 específicas para o HIV expressou PD-1 e a expressão desse receptor foi elevada em uma base por célula. Uma grande proporção de células TCD8 específicas para o HIV também expressou CD27 e CD45RO, indicando uma ativação prévia. Essas células TCD8 perderam a expressão do receptor co-estimulador CD28 e de perforina e expressavam somente duas posições de CCR7 e CD127 (receptor alfa de IL-7), as quais são importantes moléculas para a manutenção de células T de memória. Este fenótipo sugere que as células T são pobremente funcionais, não estão se transformando em células de memória e são particularmente receptivas aos sinais inibidores.
Células TCD8 em indivíduos infectados com HIV tem previamente sido apresentadas por serem disfuncionais com reduzida capacidade proliferativa e função efetora. Day e outros demonstraram que a severidade da doença, como julgada pela carga viral e declínio de contagem de CD4, era correlacionada com ambos os níveis de expressão de PD-1 nas células TCD8 específicas para o HIV e a porcentagem de células expressando PD-1, proporcionando um marcador em células TCD8 que se correlaciona com a severidade da doença. O nível de expressão de PD-1 também foi associado com o decréscimo de proliferação de células TCD8 em resposta a uma estimulação com antígeno de HIV “in vitro”. Coletivamente, esses achados demonstram que o nível de PD-1 é correlato à extensão de exaustão das células T. Day e outros e Trautmann e outros demonstraram além disso que a expressão de PD-1 em células TCD8 específicas para o HIV foi reduzida em pacientes passando por terapia anti-retroviral altamente ativa , consistentemente com a noção de que altos níveis de antígenos dirigem a expressão de PD-1 e a exaustão funcional. De acordo com Trautmann e outros, a disfunção de CD8 não resulta de alterações na expressão de TCR (receptor de célula T) ou da estimulação com peptídeos ligantes alterados.
Existem diferenças surpreendentes nos níveis de expressão de PD-1 nas células T vírus-específicas em infecções crônicas em oposição às infecções resolvidas. Células T específicas para o vírus de vacínia, o qual causa uma aguda infecção de limitação ao próprio, expressaram pouco PD-1 comparadas com os altos níveis de expressão de PD-1 expressado por células T específicas para HIV. Em contraste, células T específicas para viroses crônicas, CMV e vírus Epstein Barr, expressaram níveis de moderados para altos de PD-1, respectivamente. Isso sugere que a viremia sustentada e a apresentação de antígeno mantém os altos níveis de expressão de PD-1. Isso será importante para determinar se a sobre-regulação de PD-1 e PD-L é uma conseqüência da resposta anti-viral do interferon, e efeito indireto da ativação de células T e produção de citocinas anti-inflamatórias, ou se as proteínas do HIV sobre-regulam diretamente sua expressão.
Todos os três papéis (publicações referidas) demonstram a significância funcional da expressão de PD-1 em células T específicas para o HIV. O bloqueio de PD-L1 com um anticorpo monoclonal leva ao aumento da proliferação de células T e à produção de TNF-α, IFN-y e ganzime B, indicando um acréscimo geral da função efetora. Embora o bloqueio do curto termo da via PD-1-PD-L em um ensaio de citocina 6-h tenha tido pouco efeito na função das células TCD8 específicas para o HIV, o bloqueio desta via durante o ensaio de proliferação 6 d aumentou a proliferação de ambas as células TCD8 e TCD4 específicas para o HIV e resultou em células T mais funcionais no final da cultura. Se a proliferação é um pré-requisito para a recuperação de outras funções de células T isso permanece por ser determinado. A atividade citolítica, por exemplo, não foi examinadae será de grande interesse. Também não foi esclarecido se a recuperação do potencial proliferativo observado nos sistemas LCMV e HIV refletem crescimento na divisão celular, menos morte ou ambos.
Petrovas e outros, usaram uma lâmina ligada com anticorpo policlonal específico para PD-1 para demonstrar o relacionamento entre a redução de PD-1 com a proliferação de células T antígeno-específicas do HIV. Eles examinaram a apoptose CE células TCD8 específicas para o HIV com PD-1 + (ativa?) e acharam aumentos em ambas apoptose espontânea e mediada por Faz, sugerindo que uma comunicação cruzada pode ocorrer entre o PD-1 e os receptores de Faz. A interpretação desses achados, entretanto, é complicada pela descoberta de que células TCD8 específicas para o HIV com PD-1 negativa (inativa?) também tiveram a suscetibilidade para apoptose aumentada. É possível que outros fatores tal como níveis de ativação de células T estejam envolvidos. Células expressando níveis muito altos de PD-1 foram muito mais suscetíveis para sinais de morte, sugerindo que a expressão de PD-1 leva a um defeito de sobrevivência “in vivo”.
Por motivo da conexão entre CD4 de salvamento (helper) e a função de CD8, Day e outros também examinaram os efeitos do bloqueio a ligantes de PD-1 na expansão de células TCD4. Notavelmente, em cinco dos seis pacientes com indetectáveis respostas ao antígeno p24 do HIV por TCD4 proliferativas, o bloqueio de PD-L1 restaurou vigorosamente a expressão de células TCD4, sugerindo que as células TCD4 específicas para o HIV podem estar presentes, mas, funcionalmente diminuídas de tal modo que elas são indetectáveis em ensaios criteriais.

INFECÇÕES QUE UTILIZAM-SE DA VIA PD-1-PD-L

Em adição ao HIV e LCMV, uma variedade de micróbios patogênicos parece ter usurpado a via da ligação PD-1-PD-L para inibir a imunidade antimicrobial e o dano ao tecido do hospedeiro mediado pela imunização. Durante as infecções crônicas virais e infcções por parasitas, a sobre-regulação de PD-l e seus ligantes pode atenuar as respostas imunes e facilitar a persistência de patógenos. Por exemplo, a expressão de ligantes PD-1 é requerida para a função supressora de macrófagos e a indução de anergia [1. Ausência de capacidade de gerar uma reação de sensibilidade às substâncias esperadas como sendo antigênicas (imunogênicas e alergênicas) em determinado indivíduo. 2. Falta de energia. dic Stedman.] em células T durante infecções com helmintos Schistomosa mansoni e Taenia crassiceps. A sobre-regulação de PD-1 e seus ligantes também deve ser usada para limitar conseqüências inflamatórias com potencial pernicioso de respostas efetoras anti-microbiais. Tal como o papel promotor de PD-1 é sugerido por estudos de camundongos infectados com adenovírus PD-1-/-, os quais mais rapidamente expulsam o vírus mas desenvolvem danos hepatocelulares mais severos do que os camundongos de tipo selvagem.

CONSIDERAÇÕES E QUESTÕES NÃO RESOLVIDAS

A via PD-1-PD-L tem um papel crucial na regulação do balanço entre a ativação de células T e a tolerância. Bloqueio ou eliminação de PD-1 e seus ligantes pode acelerar e exacerbar doenças auto-imunes. O polimorfismo em um único nucleotídeo de PD-1 tem sido relacionado com muitas doenças auto-imunes, embora como o PD-1 afeta a suscetibilidade para doenças auto-imunes humanas não esteja claro. Será importante aprender como regular/ajustar esse caminho para reativar células T ao mesmo tempo minimizando o risco de auto-imunidade e imunopatologia.
Como PD-1 exerce seus efeitos inibidores? Muitos artigos tem mostrado que a sinalização de PD-1 inibe a ativação de células T. Relatórios iniciais descobriram um resultado/uma conseqüência da captura do ciclo celular além da morte celular, mas estudos recentes, incluindo o estudo de Petrovas e outros, enfatiza o papel de PD-1 em promover a morte de células T. PD-1 deve engajar diretamente uma via de morte ou mais aceitavelmente indiretamente influenciar a morte celular por sub-regulação (regulação para menos) de sinais de sobrevivência efetores e de crescimento ou sinergizando com vias de morte. Por exemplo, a ligação PD-1 inibe a expressão do gene bcl-xl de sobrevivência da célula e de vários fatores de crescimento. Os efeitos de ligação de PD-1 na expressão de receptores de morte e de vias de morte devem ser mais estudados.
As conseqüências de interações de PD-1-PD-L na expansão e sobrevivência de células T também dependem do micro-evolvimento e do tipo das APCs (células apresentadoras de antígenos) que interagem com as células T. Quando macrófagos são usados como APCs, os anticorpos monoclonais anti-PD-L1 ou anti-PD-1 aumentam a produção de IFN-y e IL-2 por células T, mas, paradoxalmante, inibem sua proliferação. Essa inibição foi causada pela produção de óxido nítrico pelos macrófagos que é dependente da indução por IFN-y, o qual (óxido nítrico de macrófagos) inibe a proliferação de células T.(Obs.: o IFN-y é produzido pelas células NK e outras talvez.)O aumento da produção de INF-y após o bloqueio de PD-L1 é visto em células T específicas pelo HIV e é um resultado comumente relatado em muitos sistemas experimentais. Assim, a combinação do bloqueio da sintetase de NO (óxido nítrico) induzido com o bloqueio de PD-1-PD-L pode ser um potencial terapêutico como um método para aumentar a resposta imune e proteger contra processos anti-inflamatórios potenciais resultantes do NO.
Para otimizar a manipulação dessa via durante a infecção viral crônica, trabalhos adicionais são necessários para compreender as funções de PD-L1 versus PD-L2, e o papel de PD-1 em células B e macrófaos e nas células T. Desde que PD-1 é expressada em células B e macrófaos e que é expressada em células T, deve haver também uma sinalização bi-direcional. Algusn relatórios descrevem a sinalização revertida de PD-L1 e PD-L2 dentro das células que as expressam. Também existem dados que sustentam que funções estimuladoras de PD-L1 e de PD-L2 sejam, possivelmente, mediadas por um segundo receptor ainda não identificado. As contribuições de cada uma dessas interações para eficácia terapêutica da manipulação dessa via precisam ser avaliadas.

CONCLUINDO OBSERVAÇÕES

Os relatórios de Petrovas e outros, Day e outros e Trautmann e outros sugerem que o bloqueio da interação PD-1-PD-L pode ser uma estratégia terapêutica para a infecção por HIV que pode permitir a reativação de respostas de células T anti-HIV. Porque esta via tem um importante papel na regulagem do balanço entre a ativação de células T e a tolerância, será importante identificar o momento ótimo e a freqüência da terapia para minimizar o risco de imunopatologias ou auto-imunidade. Os efeitos do bloqueio de somente PD-1, PD-L1 ou PD-L2 ou a combinação dos três será necessariamente avaliada por eficácia e segurança. Deverá ser benéfico cominar o bloqueio de PD-1 com a terapia anti-viral ou vacinação terapêutica. Em particular, desde que os efeitos terapêuticos de interferons sejam limitados pela indução de ligantes de PD-1, pode haver benefícios sinergéticos no bloqueio de PD-1 em conjugação com terapia com interferon. Estudos adicionais são necessários para investigar a estenção pretendida, e por quanto tempo, o bloqueio de PD-1-PD-L pode restaurar diferentes funções efetoras, particularmente a citólise (lise celular).
Gordon J. Freeman, E.John Wherry, Rafi Ahmed, e Arlene H. Sharpe
Rockfeller Press, 2 de outubro de 2006.