Capítulo “HIV-1 INTEGRASE INHIBITORS: UPDATE AND PERSPECTIVES” ; autores: Elena A. Semenova, Christophe Marchand, e Yves Pommier; do livro: HIV-1 MOLECULAR BIOLOGY AND PATHOGENESIS, CLINICAL APPLICATIONS, DE KUAN-TEH JEANG

INIBIDORES DE INTEGRASE: ATUALIZAÇÃO E PERSPECTIVAS

I-VISÃO GERAL DO CAPÍTULO

A replicação do HIV requer a inserção do genoma viral dentro do genoma nuclear de células infectadas através de um processo de recombinação catalisado pela enzima codificada pelo vírus, Integrase (IN). A Integrase do HIV tem sido recentemente reconhecida como um objetivo anti-viral atingível, seguindo os resultados promissores de inibidores de Integrase em testes clínicos. Este capítulo foca os avanços recentes no entendimento dos mecanismos celulares de integração do HIV e os sítios de atuação de inbidores. Ele também proporciona uma lista extensiva das mutações conhecidas que têm caracterizado a Integrase do HIV-1 com seu impacto na atividade da enzima IN, replicação viral, e resposta a drogas anti-IN. Novas abordagens razoáveis para inibição da integração do HIV também são discutidas, assim como os dois inibidores de Integrase em testes clínicos e outros inibidores selecionados em desenvolimento.

II - PRÓLOGO

Os resultados encorajadores informados e o conhecimento recente sobre os co-fatores de integração do DNA têm renovado o interesse na farmacologia da Integrase do HIV e na biologia celular. O capítulo corrente oferece uma visão geral das funções dos co-fatores de Integrase para a integração. Ele foca as abordagens farmacológicas para interferir com a integração e proporciona uma extensiva lista de mutações da IN com seus impactos farmacológicos e funcionais. Referências têm sido mantidas para o mínimo. Informações adicionais podem ser encontradas em revisões recentes (Dayan et al,2006; Marchand et al, 2006ª; Pommier et al, 2005; Savarino, 2006. Semenova et al, 2006b; Zhao et al, 2007).

III- Integração: uma etapa crucial no ciclo de vida do HIV.

Semelhante a outras retroviroses, o genoma do HIV consiste em fitas singulares de RNA. Durante a infecção, o RNA é liberado na célula hospedeira sugerindo a fusão de partículas virais com a membrana celular. O RNA viral então serve como um padrão para a síntese de uma fita dupla de DNA copiada do RNA viral (cDNA) produzindo longos terminais de repetição (LTRs) pela transcriptase reversa (RT) codificada do HIV. A conversão do RNA viral em cDNA é necessária para a produção de novas cópias de RNA e para a transcrição de genes codificadores virais. A transcrição do cDNA viral também requer sua inserção em um cromossomo hospedeiro. Essa inserção (integração) é catalisada pela enzima codificada do HIV IN (Integrase). O cDNA viral integrado no cromossomo hospedeiro é chamado pró-vírus. Dependendo do sítio de integração, o pró-vírus pode ser constitutivamente transcrito se ele é integrado perto de um promotor ativo, ou permanecer silencioso até a resposta por pressão de disparadores de transcrição. A transcrição do genoma viral e dos genes virais seguida de tradução, empacotamento , fusão e maturação fornecem os componentes moleculares para a liberação de novas partículas virais infecciosas.

A)A ESTRUTURA DA INTEGRASE DO HIV-1.

As três enzimas virais (protease, transcriptase reversa e integrase) são codificadas dentro do gene POL do HIV e traduzidas em uma poli-proteína. A Integrase (32kDa) é liberada da poli-proteína pela protease do HIV durante a maturação. A proteína IN consiste de três domínios: N-terminal (extremidade da cadeia peptídica que termina em NH2, nas ligações entre aminoácidos, amídicas, um NH2 do carbono alfa de um aminoácido liga-se ao COOH unido ao carbono alfa do outro aminoácido;obs. da trad.), cerne (ou catalítico) e domínio C-terminal (extremidade que termina em COOH, sendo assim, a seqüencia de aminoácidos cresce da ponta livre em NH2 para a ponta livre em COOH.;obs. da trad.). O domínio N-terminal intensifica a multimerização através da coordenação de zinco (motivo HHCC) e promove a integração combinada e duas extremidades de cDNA virais juntas dentro do cromossomo da célula hospedeira. O domínio C-terminal é responsável pela ligação de DNA independente de seqüência e independente de metal. Cada molécula de integrase do HIV-1 contém um sítio catalítico dentro do domínio do cerne carregando três aminoácidos essenciais: Asp64, Asp 116 e Glu152 (motivo D,D-35-E). Estes resíduos ácidos coordenam ao todo um, e provavelmente, dois cátions divalentes (Mg2+ ou Mn2+) que formam uma ponte com os substratos de DNA. A mutação de algum destes resíduos extingue a atividade enzimática da IN e a replicação viral. A IN funciona como um multímero.

B)QUÍMICA DE INTEGRAÇÃO RETROVIRAL

Durante a primeira reação catalisada pela IN [3’-processado (3’-P)], o DNA doador (viral) é hidrolisado imediatamente no lado 3’ a partir do dinucleotídeo conservado CA (dinucleotídeo são dois nucleotídeos ligados no sentido de fita, não no sentido de pares de base, quando formam pontes de hidrogênio com a combinação C-G, ou A-T; obs. da trad.) em ambos finais 3’ (de cada fita do DNA viral duplo) das duas seqüências de repetição nas extremidades (LTRs). 3’-P liberam os nucleotídeos terminais de 3’ (geralmente os dinucleotídeos GT para o HIV-1) e geram finais 3’-hidroxila (-OH) nucleofílicos (nucleofílica é a reação que envolve um nucleófilo; nucleófilo é o átomo doador de um par de elétrons numa reação química, em que o par de elétrons é capturado por um eletrófilo; qualquer reagente ou substância atraída para uma região de baixa densidade eletrônica. Dic. Stedman) em ambas extremidades do DNA viral. O próximo passo, a integração [transferência de fita(ST)] procede no núcleo através de uma reação de transesterificação (?), onde os finais 3’-OH nucleofílicos processados do cDNA doador (viral) são inseridos na espinha dorsal do alvo de DNA hospedeiro. Ambos finais (extremidades) inserem-se com cinco pares de bases hesitantes através do sulco maior do DNA (a hélice de DNA não forma sulcos regulares entre os giros; obs. da trad.) cromossômico tarjado, seguindo o acompanhamento das junções de fenda e ligação do cDNA do HIV integrado pelo mecanismo de reparo de DNA da célula hospedeira (Alguma enzima DNA ligase deve fixar as extremidades coesivas dos LTRs virais com o sítio de inserção; obs da trad.)

C) A INTEGRAÇÃO OCORRE DENTRO DE UM GRANDE COMPLEXO MACROMOLECULAR

A integração celular requer vários co-fatores em adição à IN. O complexo de pré-integração (PIC) é uma unidade estrutural crucial para a integração. O PIC contém proteínas de ambos o cerne viral (matriz, nucleocapsídeo, transcriptase reversa) e da célula hospedeira [LEDGEF/p75, o fator derivado das lentes epiteliais), um interador de integrase 1 (INI1), o fator de barreira de auto-integração (BAF), a proteína A1 de alta mobilidade de grupo cromossômico (HMGA1)]. O cDNA viral é provavelmente ligado à IN seguindo imediatamente a transcrição reversa. A IN também liga-se diretamente ao LEDGEF/p75, INI1, transcriptase reversa e matriz.
Não obstante muitas informações descrevendo a importância dos co-fatores de integração do HIV, nosso entendimento dos mecanismos de regulação da integração permanecem incompletos. Em nossa opinião, a principal função do PIC é separar as duas reações catalisadas pela Integrase (3’-P e ST) em diferentes compartimentos celulares durante o momento “in vivo”, enquanto “in vitro” essas duas reações ocorram conseqüentemente sem atraso (sem adiamento). É plausível que a IN possa ser mantida inativa no PIC antes da migração para o núcleo para prevenir a auto-integração. Um co-fator celular presente no PICm a BAF, impede a auto-integração. Outros fatores associados ao PIC provavelmente tembém mantém a IN inativa. Por hora, a transcriptase reverda do HIV pode inibir as atividades catalíticas da IN “in vitro”. O cDNA viral é protegido da digestão por nucleases ap´s o isolamento do PIC somente com a IN de tipo selvagem (não mutada; obs. da trad.), enquanto torna-se sensível à digestão por nucleases quando o PIC é formado por integrases mutantes. Assim, a IN é provavelmente envolvida não somente no 3’-P bem cedo no cico viral, mas também na formação do PIC. A formação do PIC pode ser disparada quando ocorre o processamento completo da reação 3’-P pela integrase. Também é aceitável que o rearranjo do PIC, levando à reativação da IN, ocorra durante a passagem do PIC através do envelope nuclear (a membrana nuclear ) e/ ou durante sua associação com a cromatina.
Nós focaremos dois fatores que são conhecidos por fixar o cDNA viral ao DNA cromossômico do hospedeiro, a emerin e a LEDGEF/p75. Recentemente, a interação do cDNA viral com a cromatina tem sido anunciado como dependente de emerin, uma proteína nuclear associada ao PIC através da proteína BAF. Ambas emerim e BAF são requeridas para a localização apropriada do cDNA viral no núcleo antes da integração. Entretanto, a emerin e a BAF não facilitam a integração do HIV. Outra molécula de fixação da IN do HIV à cromatina é a LEDGEF/p75. Ligações de LEDGEF/p75 à IN direcionam a IN para a cromatina e promovem a transferência de fita. A falha da replicação do HIV em células nocauteadas para LEDGEF/p75 sugere que a LEDGEF/p75 é um co-fator crítico para a integração eficiente do HIV. A ruptura dessas interações com a IN poderá ser considerada como uma estratégia terapêutica.

IV- ABORDAGENS PARA INIBIR A INTEGRAÇÃO DO HIV.

A)Pequenas Moléculas Inibidoras das Atividades Enzimáticas da Integrase do HIV.

Procurando por inibidores enzimáticos da IN é fácil de compreender. Ensaios altamente produtivos têm sido desenvolvidos, e muitos ensaios “in vitro” são rotineiramente usados para elucidar os mecanismos de ação das drogas (Marchand e outros, 2001). Ensaios de 3’-P monitoram a liberação do dinucleotídeo terminal (GT) a partir de um oligonucleotídeo duplo (de fita dupla) que imita o final do longo terminal de repetição (LTR) viral enquanto a transferência de fita resulta numa grande molécula de DNA. Substratos clivados previamente (final 3’ processado pela IN) são usados para determinar a inibição de transferência de fita independentemente de 3’-P. A desintegração (desagregação), a terceira reação catalizada pela IN [ao contrário da reação de ST, (Chow e outros,1992)], pode ser usada para avaliar o sítio de atuação das drogas, como esta é a única reação que pode ser catalizada pelo cerne da IN. Compostos que competem com alvos de DNA dentro do sítio catalítico da enzima produzem inibição preferencial da Transferência de Fita sobre o 3’-P e são geralmente inefetivos contra a desintegração (Espeseth e outros , 2000). Estes inibidores são comumente referidos como “inibidores de transferência de fita” (STI). Em contraste, inibidores que previnem a ligação do DNA viral à integrase inibem ambos o 3’-P e a ST com eficiência similar (Bonnenfant e outros, 2004; Marchand e outros, 2006b).
Como permanece difícil obter drogas de integrase em estrutura de cristal (com formatos regulares entre as moléculas), os ensaios sobre a ligação da IN e o DNA continuam por ser desenvolvidos para investigação de sítios de ligação para drogas no complexo IN-DNA. Os ensaios de base Schiff (Mazumder e Pommier, 1995) e a ligação atravessada dissulfídica (Johnson e outros, 2006) podem ser usados para determinar se uma dada droga afeta a ligação do DNA à IN ou se altera o contato crucial da transferência de fita entre o resíduo de aminoácido Q148 da IN e a citosina no final proeminente do DNA viral (Johnson e outros, 2007). Um novo inibidor de sítio de ligação da IN do HIV foi descoberto no dispositivo dimérico do cerne da IN, usando-se análises de marcadores de foto-afinidade e espectrometria de massa [espectrometria é um procedimento para observar e medir os componentes de onda de luz ou outras emissões eletromagnéticas. Dic.Stedman] (Al-Marvsawi e outros, 2006).
O desenvolvimento de inibidores têm focado o alvejamento do motivo D,D-35-E e o quelado de metal divalente (Mg2+ versus Mn2+) ligado na interface do complexo IN-DNA (Semenova e outros, 2006b). Nós temos nos referido a esse modo de inibição como “inibição interacial” (Pommier e Cherfils, 2005; Pommier e outros, 2005; Pommier e Marchand, 2005) porque a droga liga-se na interface de duas macromoléculas (aqui a IN e o DNA), um intermediário catalítico (aqui a etapa 3’-P), dessa forma prevenindo a atividade catalítica produtiva (aqui a transferência de fita, ST). A inibição interfacial é comumente observada por amplo raio de ação de produtos naturais alvejando uma variedade de alvos celulares (Pommier e Cherfils, 2005). Uma atenção foi dada ao motivo D,D-35-E depois de 5CITEP [um ácido diqueto (DKA) derivativo similar] ter sido primeiro co-cristalizado no domínio catalítico da IN do HIV e demonstrado ligar-se com o motivo D,D-35-E (Goldgin e outros, 1999). Inibidores de IN correntemente em testes clínicos também contém os motivos semelhantes a DKA que são creditados por quelarem cátions divalentes (Mg2+ ou Mn2+) dentro do motivo D,D-35-E. Estas drogas demonstraram inibição preferencial à reação de transferência de fita. Inibidores de transferência de fita (STI) preferenciais foram primeiro observados por CAPE (éster fenetílico ácido cafeico) e julgado por estar relacionado à quelação dos metais divalentes da IN (Fesen e outros, 1993). Esse modelo foi melhor desenvolvido para os derivativos de DKA, os quais eram apresentados por atuar como competidores para o DNA alvo do cromossomo do hospedeiro no sítio de atividade da IN (Hazuda e outros, 2000). Os benefícios dos inibidores de transferência de fita emergiram com a caracterização de componentes mais potentes de DKA efetivos contra a infecção por HIV (tabelas II e III). Os resíduos de IN envolvidos na resistência a DKA e semelhantes a DKA estão listados na tabela I.
Como o 3’-P é um pré-requisito para a transferência de fita e a integração do HIV, e é provavelmente requerido para a formação do PIC, a inibição da reação 3’-P é uma abordagem racional para inibir a replicação do HIV. Também é lógico combinar inibidores de 3’-P com os inibidores de ST correntemente desenvolvidos.
Um derivativo de stirilquinolina (SQL), FZ-41, inibe ambos 3’-P e ST com similar eficiência (Bonnenfant e outros, 2004), e tem sido confirmado como um inibidor de Integrase do HIV celular pelo desenvolvimento de viroses resistentes a drogas. A atividade anti-viral de FZ-41 pode servir como um paradigma para inibidores de ‘-P que também podem prevenir a formação do PIC. A inibição de importação nuclear de Integrase após o tratamento com SQL pode ser uma conseqüência da falha na formação do PIC. (Mousnier e outros , 2004).

B.A marcação do PIC

De acordo com o paradigma de uma inibição interfacial (Pommier e Cherfils, 2005; Pommier e Marchand, 2005), as interações proteína-proteína (monômero de IN- monômero de IN, IN-LEDGEF/p75, IN-matrix, IN-INI!, matrix, BAF, etc.) e funções da proteína com DNA (IN-DNAviral, BAF-DNA viral, etc) dentro do PIC são igualmente importantes para a integração. Alterações em qualquer dessas interfaces podem evitar a integração. Por exemplo, inibidores do tipo DKA altera o alvo de superfície de ligação do DNA dentro do sítio de atividade da IN (interface de proteína e DNA) devido à quelação de cátions divalentes após a etapa 3’-P. Outro candidato alvo é LEDGEF/p75, pois a replicação do HIV é marcadamente reduzida em células sem LEDGEF/p75 devido à abstenção da interação IN-LEDGEF/p75 (Vandekerckhove e outros, 2006). Por isso, prevenção ou alteração de contatos de macromoléculas entre componentes do PIC é uma abordagem racional e promitente para a inibição da integração do HIV. Resíduos de IN específicos interagindo com os componentes do PIC são culminados na Tabela I. Ensaios desenvolvidos para identificar inibidores de funções enzimáticas da IN (contato proteína-DNA) podem não identificar inibidores interfaciais pois os contatos interfaciais com os componentes do PIC não são requeridos para as atividades enzimáticas de IN “in vitro”. (Emiliani e outros, 2005). Tais compostos poderiam ser por isso erroneamente excluídos durante a rotina de verificação bioquímica, embora eles ainda possam alterar a formação do PIC “in vivo”, o que ressalta a necessidade de desenvolverem-se ensaios adicionais para inibidores de integrase.