REPRODUÇÃO PARCIAL DE : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=300384
*300384 EMERIN; EMD
Alternative titles; symbols
STA, INCLUDED
Gene map locus Xq28
TEXTO
DESCRIÇÃO
O gene EMD codifica uma proteína ubíqua, emerim, que é encontrada ao longo da borda de muitos tipos de células e é um membro da família de proteínas associadas à lâmina nuclear. Mutações no gene EMD tem sido estabelecidas como causadoras da distrofia muscular de tipo Emery-Dreifuss.
CLONAGEM
Bione e outros (1993) construíram um mapa transcricional da região 2-Mb do Xq28 ao qual a distrofia muscular Emery-Dreifuss tem sido mapeada através de estudos de ligação. Dentro desta região, eles identificaram o gene STA. Bione e outros (1994) determinaram que STA (EMD) codifica uma proteína de 254 aminoácidos, denominada emerin, a qual carece de um peptídeo sinal, contem um domínio longo no terminal N, e é hidrofílica exceto por uma região hidrofóbica de 20 aminoácidos em seqüência na região do terminal C. Ela tem vários sítios de fosforilação putativos e um sítio com potencial de glicosilação. Análises de Northern blot demonstraram a expressão ubíqua de um transcrito principal de aproximadamente 1-kb, com alta expressão no músculo esquelético e no coração e abundante expressão em outros tecidos, incluindo o colo, testículos, ovário e placenta. Bione e outros (1994) sugeriram que a emerin pertença a uma classe de proteínas de cauda ancorada na membrana das rotas secretoras envolvidas no transporte vesicular.
Manilal e outros (1996) desenvolveram um painel de doze anticorpos monoclonais para um largo fragmento de cDNA de emerin preparado através de PCR e expressado como uma proteína recombinante em E.coli. Estes anticorpos detectaram quatro diferentes epítopos na emerin. Todos os anticorpos monocloais reconheceram uma proteína de 34-kD em todos os tecidos testados. Estudos de imunofluorescência e fracionamento celular confirmaram que a emerin está localizada na membrana nuclear. Similaridades entre as seqüências de aminoácidos e a localização celular sugeriram que a emerin seja um membro da família de proteínas associadas à lamina nuclear.
Small e outros (1997) isolaram e caracterizaram o gene complete da emerin do camundongo. O gene da emerin no camundongo tem 2.9 kb, compreende 6 éxons e codifica uma proteína 73% idêntica à proteína humana. Assim como o humano, o gene codifica uma proteína rica em serina similar à proteína 2 associada à lâmina (LAP2) e apresenta críticos sítios de f
fosforilação de LAP2.
FUNÇÃO DO GENE
Cartegni e outros (1997) relataram que a emerin se localiza no interior da membrane nuclear por via de seu domínio hidrofóbico no terminal C, porém que no coração e miocardiocites cultivadas, ela também está associada com os discos intercalados. Eles propuseram um papel genérico para a emerin na ancoragem da membrana ao citoesquelet. No envelope nuclear, a emerin atua num papel onipresente (ubíquo) e indispensável em associação à membrana nuclear com a lâmina. No coração, ela é específicamente localizada nos desmossomos ( local de adesão entre duas células epiteliais) e aderentes fasciais (lâmina de tecido fibroso).
Desmossomos e aderentes fasciais ancoram em filamentos intermediários contendo desmina e as bandas de mio-filamentos sarcoméricos, respectivamente. Eles consistem de glicoproteínas adesivas transmembranas, membros da superfamília das caderinas, e das proteínas citoplasmáticas tais como vinculina, caterinas e proteínas ligantes de actina. Dferentes classificações da mesma ou de proteínas similares nos desmossomos, aderentes fasciais, adesões pontuais, e outras junções adesivas parecem conferir funções específicas para assegurar/proteger a comunicação célula-célula e a adesão restrita entre as células e para com a matriz extracelular.
O papel desse complexo de variadas proteínas é melhor demonstrad pela existência de muitas doenças genéticas que perturbam a adesão e, no coração, através de dramáticas conseqüências de placoglobina (um produto da reação da globina com alguma substância) (gama-catenina) inativa (Ruiz e outros, 1996): camundongos com placoglobina -/- morreram na metade da gestação devido à ruptura dos ventrículos. No coração, a específica localização da emerin nos desmossomos e aderentes fasciais, pode contar para defeitos característicos de condução descritos em pacientes com distrofia muscular Emery-Dreifuss.
Yorifuji e outros (1997) igualmente demonstraram que a emerin está localizada no interior da membrana nuclear. Estudos de localização ultra-estrutural da proteína no músculo esquelético humano e em células HeLa (primeiras células de um carcinoma cervical humano; obs: carcinoma no pescoço deve ser genericamente relacionado a qualquer tecido nesta localização?), usando crioseções (seções de frio) ultrafinas, demonstraram que partículas áureas coloidais etiquetadas imunologicamente estavam localizadas na superfície nucleoplásmica do interior da membrana nuclear, mas não no poro nuclear. Eles interpretaram seus resultados como indicadores de que a emerin ancora no interior da membrana nuclear através da extensão hidrofóbica e projeta-se a partir da região hidofílica para o plasma nuclear onde interage com a lâmina nuclear. Eles especularam que a emerin contribui na manutenção da estrutura e estabilidade nuclear, assim como para as funções nucleares, particularmente nos tecidos musculares que sofrem tensão severa com rigorosos movimentos de contraçõe-relaxamento e fluxo de cálcio.
Através de análises de mutação, Lee e outros (2001) determinaram que várias, mas não todas, as doenças ligadas à mutação na emerim mapeiam para um domínio central de ligação à lamina A (LMNA: Laminas são proteínas estruturais componentes da lâmina nuclear), e que mutações nesta região rompem a interação entre emerin e lamina A. Eles também descobriram que a emerin liga-se diretamente à BAF (BANF1), uma proteína de ligação ao DNA, e que esta ligação requer resíduos conservados no terminal N do domínio LEM da emerin. Todas as doenças ligadas a proteínas da emerin permanecem ativas para ligação com BAF tanto “in vitro” quanto “in vivo”.
Haraguchi e outros (2001) visualizaram uma co-localização entre emerin e BAF no cerne da região de cromossomos durante a telófase em células HeLa. Uma emerin defeituosa mutante na ligação com BAF in vitro falhou em localizar-se neste cerne em vivo e subseqüentemente falhou em localizar-se no envelope nuclear reformado. Em células HeLa expressando uma BAF mutante que não apresentou a localização do cerne, emerin endógenas falharam em localizar-se na região do cerne durante a telófase e não se reuniu dentro do envelope nuclear durante a interfase subseqüente. Esta BAF mutante também dominantemente deslocou LAP2-beta e a lamina A do envelope nuclear. Haraguchi e outros (2001) concluíram que BAF é requerida para a reunião da emerin com as laminas de tipo A no envelope nuclear em reforma durante a telófase e pode mediar sua estabilidade na interfase subseqüente.
Jaque e Stevenson (2006) examinaram a suscetibilidade de macrófagos primários para infecção por vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) seguindo pequenos RNA de interferância mediadores do silenciamento das laminas nucleares e várias proteínas associadas à lamina. Eles descobriram que o sileciamento da emerin e de BAF preveniu (impediu) a infecção com HIV-1, mas não o vírus da leucemia murina, através da prevenção da integração do vírus dentro do DNA hospedeiro. Análises de imunoprecipitação da cromatina identificaram a emerin e a BAF como co-fatores cooperadores do HIV-1, e análises de mutação demonstraram que o cDNA viral não se associou com a BAF defeituosa na ligação com emerin ou com a emerin sem o domínio LEM. Jacque e Stevenson (2006) concluíram que o cDNA do HIV-1, após entrar no núcleo, tem que interagir com emerin para o contato com a cromatina, e eles sugeriram que moléculas que impedem essas interações devem promover uma infecção abortiva do HIV-1 na célula.
ESTRUTURA DO GENE
Bione e outros (1995) relataram a seqüência do gene EMD, a qual tem o comprimento de 2.100 pares de bases. O gene contém seis éxons.
MAPEAMENTO
Bione e outros (1994) identificaram o gene EMD num mapa transcricional de Xq28.
sábado, 28 de junho de 2008
sábado, 14 de junho de 2008
Tradução
CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY, Feb. 2008, p. 284–292 Vol. 15, No. 2
1556-6811/08/$08.00_0 doi:10.1128/CVI.00221-07
Copyright © 2008, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
Therapeutic Immunization with Human Immunodeficiency Virus Type 1
(HIV-1) Peptide-Loaded Dendritic Cells Is Safe and Induces
Immunogenicity in HIV-1-Infected Individuals_
Nancy C. Connolly,1 Theresa L. Whiteside,4 Cara Wilson,2,3 Venkatswarlu Kondragunta,5
Charles R. Rinaldo,2,6 and Sharon A. Riddler2,6*
Received 31 May 2007/Returned for modification 7 August 2007/Accepted 9 October 2007
A administração de potente terapia anti-retroviral (ART) resulta num dramático declínio da morbideza e mortalidade devida à infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) para a maioria das pessoas tratadas. A iniciação da terapia anti-retroviral é normalmente acompanhada de decréscimo substancial na carga viral do HIV-1 e aumento da contagem de linfócitos TCD4. Estudos com sobrevventes de longo prazo e cm sujeitos tratados durante a infecção aguda demonstram que respostas vigorosas de linfócitos T citotóxicos (CTL) específicos para o HIV-1 e fortes respostas de linfócitos T Helpers 1 (TH1) correlacionam-se com o controle de longo prazo da replicação do HIV-1 na ausência de terapia, resultando em prolongada sobrevivência livre de sintomas.
Desafortunadamente, a limitada restauração de células T-Helpers específicas para o HIV-1 e a reatividade das CTLs em pessoas com infecção crônica do HIV-1 em terapia anti-retroviral comanda a terapia vitalícia e geralmente persistente, não obstante o baixo nível da replicação viral. Enquanto as respostas imunes inata e adquirida parecem ser responsáveis pelo controle inicial da viremia na infecção aguda do HIV-1, a ocorrência de respostas imunes naturalmente parece enfraquecer sobre o tempo na maioria dos indivíduos infectados, resultando na progressão da doença.
Indivíduos infectados pelo HIV-1 em terapia anti-retroviral com supressão da carga viral plasmática progressivamente perdem as células T citotóxicas específicas para o HIV-1, sugerindo que a viremia persistente é requerida para as altas freqüências de células T citotóxicas específicas para o HIV-1. Na infecção crônica do HIV-1, a descontinuidade da terapia anti-retroviral tem sido uniformemente acompanhada de um rápido retorno de RNA do HIV-1 no plasma correspondente ao pré-tratamento, níveis estáveis de estado, indicando a persistência do reservatório do HIV e ausência de controle imune. Por estas razões, estratégias imunoterapêuticas com o potencial de suprimir a replicação viral e com a meta de elicitar ampla, robusta e durável resposta de TH1 e CTLs específicas para o HIV-1 são necessárias.
Células dendríticas (DC) são conhecidas por desempenhar um crítico papel na geração de respostas imunes altamente específicas contra uma variedade de patógenos. As DC adquirem antígenos na periferia e, no momento de ativação apropriada, migram para os linfonodos, onde elas iniciam a geração de respostas de células TCD4 e TCD8 antígeno-específicas. As DC tem sido extensivamente usadas como adjuvantes e carregadoras de antígenos nas estratégias vacinais para uma variedade de enfermidades, malignidades primárias, para induzir as respostas de células T antígeno-específicas com pequena ou nenhuma toxidade.
Nós e outros propusemos que células dendríticas expressando antígenos poderiam ser uma efetiva imunoterapia para a infecção do HIV-1. Para testar este de conceito, num estudo seguro de fase I, nós usamos células dendríticas autólogas (da própria pessoa) carregadas com peptídeos de CTLs restritos ao HLA*A0201, imunodominante, incluindo três diferentes peptídeos do HIV-1 e um peptídeo da proteína matrix de um único vírus influenza A para imunização. Vacinas baseadas em peptídeos são limitadas pela necessidade de especificidade para o HLA (o alelo do HLA pode não reagir ao peptídeo).
Por isso nós escolhemos para este estudo três peptídeos de HIV-1 CTL que representam um subconjunto seleto de peptídeos do HIV-1 de síntese altamente conservada os quais foram derivados de três proteínas estruturais principais do HIV-1 (Env, Gag e Pol. OBS.: as mesmas usadas na vacina do Dr. Luis Cláudio Arraes) e que exibiram reação cruzada com o complexo maior de histocompatibilidade ligando-se à família supertipo HLA-A2. Cada um desses peptídeos-epítopos de HIV-1 CTL induz a recuperação de respostas de CTLs nos indivíduos infectados pelo HIV-1. O peptídeo 58-66 (do aminoácido 58 ao 66) da proteína matrix do vírus influenza A representa um epítopo dominante reconhecido pela maioria dos indivíduos positivos para o HLA*A0201. Isso tem sido seguramente e efetivamente usado como um imunógeno em numerosos estudos de vacinação. Aqui nós apresentamos os resultados dos testes clínicos da fase I designada para avaliar a segurança e a executividade de células dendríticas autólogas carregadas com peptídeos sintetizados do HIV-1.
MATERIALS AND METHODS ...
RESULTADOS
Praticipantes do estudo.
As característcas da linha de base desse estudo de população estão listadas na Tabela 1. Os sujeitos estudados foram na maior parte homens (15/18) e brancos (16/18), com idade média de 44 anos. A média de contagem de células TCD4, da linha de base foi de 645 células por milímetro cúbico (ml), e profundeza da média de células TCD4 foi 259 células por mm3 (n_17); seis sujeitos tiveram contagem de células TCD4 profundas de 150 células/mm3, e um sujeito não contagem de células TCD4 profundas em valor avaliável. Todos os sujeitos completaram ao todo 24 semanas de acompanhamento; um deles retirado em acordo (após 24 semanas) e um segundo faleceram devido a causas não informadas nesse estudo vacinal (40 semanas).
Segurança.
As imunizações com peptídeos do HIV de células dendríticas autólogas foram em geral seguras e bem toleradas. Dezessete indivíduos receberam ambas as doses da vacina. Um deles (alta dose, s.c) experimentou um grau de febre 3 nunca registrado (1040F) no dia seguinte à primeira vacinação, o que foi considerado relativo à vacina, e na segunda vacina retido. Nenhum outro evento de graduação de 3 ou 4 laboratorial ou clínico informado nesse estudo foi observado. A contagem de células TCD4 permaneceu estável e as cargas virais permaneceram suprimidas em menos de 50 cópias/ml durante o acompanhamento.
A produção da vacina.
Um indivíduo (de baixa dose, i.v.) foi incapaz de suportar leucaférese (um procedimento em que os leucócitos são removidos do sangue coletado e o restante do sangue é retransfundido para o doador) devido a irreularidades anatômicas. Para este indivíduo, células dendríticas abundantes foram obtidas a partir de 100 ml de sangue periférico retiradas uma semana antes de cada dose vacinal. Para os sujeitos remanescentes, as células dendríticas substanciais foram geradas de um único produto de leucaférese para permitir a preparação das múltiplas doses vacinais. As células dendríticas geradas dos participantes do estudo eram similares às células dendríticas obtidas de um grupo de pessoas voluntárias (controle) não infectadas com respeito ao rendimento, viabilidade, pureza e fenótipo (tabela 2) (descritos em mais detalhes adiante). O rendimento principal foi de 9.1_107 (raio de ação 1.3_107 para 2.7_108) para o grupo de controle não infectado. A viabilidade principal e a pureza foram 93% (alcance 69 a 99%) e 100% (alcance 47% para 100%), respectivamente, comparada com 90% (alcance, 85% para 95%) e 77% (alcance, 75% para 89%) para o grupo de controle não infectado. A produção de IL-12p70, uma medição da função das células dendríticas, foi variável mas estatisticamente não diferente daquela dos doadores normais. Não houve estatisticamente diferenças significativas entre as características fenotípicas das células dendríticas imaturas ou de mDC (células dendríticas maduras) geradas de monócitos dos 18 participantes do estudo com infecção crônica do HIV-1 e as dos 15 doadores normais, como demonstrado previamente.
Respostas imunológicas.
Na linha de base, 9 dos 18 indivíduos tiveram respostas para um ou mais peptídeos do HIV-1, e 12 dos 18 tiveram resposta ao peptídeo da proteína matrix do vírus A. Três indivíduos tiveram respostas significativas para todos os quatro peptídeos. Seguindo a vacinação, em agregamento, aumentos estatísticamente significativos na freqüência de células TCD8 respondedoras ao Gag do HIV-1 (P_0.02) e ao Pol do Hiv-1 (P_0.04) foram observadas na sexta semana. Nenhuma diferença significativa foi observada entre as rotinas de administração i.v. e s.c. Uma diferença significativa foi observada entre as doses alta e baixa na quarta semana para o Env do HIV-1 (P_0.04), e uma tendência em direção à resposta significativa foi observada na quarta semana para Gag (P_0.07) e nas sexta (P_0.1) e oitava (P_0.05) semanas para o Pol do HIV-1. As variabilidades interindividuais consideráveis foram registradas no aumento geral de respostas de células TCD8, e o resultado significativo foi atribuível à fortes respostas vistas com células de alguns indivíduos. Finalmente, nós investigamos o efeito de pré-ART CD4 (CD4 profundas anti-retrovirais anteriores à terapia) profundas através do agrupamento de pacientes baseado por suas CD4 profundas (150 versus 150 células /mm3). Uma tênue tendência em direção à mais imunogenicidade no grupo com mais células CD4+ profundas foi observada, particularmente na sexta semana para o Env do HIV-1 (P_0.1), mas diferenças muito significativas não foram notadas.
Discussão.
Neste estudo, nós demonstramos que a vacinação com células dendríticas autólogas cadenciadas com HLA-A2 restrita aos peptídeos do HIV-1 foi segura e executável na infecção crônica pelo HIV-1, em sujeitos tratados com terapia anti-retroviral (ART). Além disso, embora somente duas vacinas tenham sido dadas, a geração de respostas imunológicas específicas ao HIV-1 foram observadas na situação da infecção crônica por HIV-1.
A vacinação com base em células dendríticas representa uma ferramenta potencialmente promissora para aumentar a resposta imunológica do portador contra a infecção pelo HIV-1. Esse estudo representa a maior e mais completo teste descrito de vacinação com células dendríticas autólogas em indivíduos tratados com ART e determina fundamentalização para futuros testes de aumento imunogênico utilizado em terapias baseadas na imunidade. Terapias de base imunológica nesta população tem o potencial de ser uma adição crucial avaliável para a terapia anti-retroviral corrente desde que nós nos empenhemos para a cura mais do que meramente o tratamento da infecção por HIV-1. A despeito de anos de pesquisa, permance desconhecido se a manipulação da imunidade é segura e se pode diminuir a viremia e aumentar o controle imunológico em pessoas infectadas cronicamente pelo HIV-1. Nosso teste examinou a segurança e a eficácia de uma terapia vacinal em sujeitos infectados pelo HIV-1 em terapia anti-retroviral.
Os resultados desse estudo assim como caracterização adicional das propriedades das células dendríticas dos participantes do estudo na linha de base indicaram que células dendríticas derivadas de monócitos obtidas por leucaférese de sujeitos infectados cronicamente pelo HIV-1 com carga viral suprimida foi, com poucas exceções, fenotipicamente e funcionalmente comparável às células dendríticas de doadores normais.
As seleções de antígenos e adjuvantes são de importância crucial em todas as estratégias vacinais. O uso de células dendríticas como adjuvante para vacinação foi largamente desenvolvido em testes contra o câncer, em que o uso de peptídeos sintéticos como antígenos tem muitas vantegens: eles são relativamente fáceis de produzir, são hábeis para o monitoramento de respostas celulares peptídeo-específicas, eles excluem a possibilidade de infecção por produto vacinal, e eles minimizam o risco de geração de imunidade contra antígenos próprios. Por essas razões, os peptídeos sintéticos específicos do HIV-1 foram escolhidos para esta fase I de estudo de segurança e executabilidade de imunização baseada em células dendríticas nesse grupo tratado com terapia anti-retroviral. Permanece desconhecido, e é um assunto para mais estudos, qual emergirá como um antígeno ótimo para vacinação contra o HIV-1, enquanto terapia ou profilaxia. Aqui nós demonstramos que a administraação de somente duas doses de células dendríticas expostas a peptídeos sintéticos, embora com relativamente limitada especificidade, representa uma estratégia imunogênica potencial e executável.
A marca das estratégias imunoterapêuticas para infecção por HIV-1, i.e., para diminuir a carga viral e aumentar a contagem de células CD4, é conhecida através de anos de testes clínicos e observações correlatas com decréscimo da morbidade e da mortalidade resultante da infecção por HIV-1. Esse estudo não foi designado nem atribuído para detectar uma respota imunológica ou clínica. A despeito disso, nós demonstramos não somente que as cargas virais e a contagem de CD4 permaneceu inalterada, mas que certamente os indivíduos apresentaram aumento em sua resposta de células T CD8 específica para peptídeos do HIV-1.
Os resultados de outras três fases I de testes baseadas em imunização terapêutica com células dendríticas autólogas foram publicados recentemente. Lu e outros (Lu, W., L. C. Arraes, W. T. Ferreira, and J. M. Andrieu. 2004. Therapeuticdendritic-cell vaccine for chronic HIV-1 infection Nat. Med. 10:1359–1365) usaram células dendríticas autólogas cadenciadas com HIV-1 autólogos inativados em 18 sujeitos brasileiros naïve (não expostos) ART (à terapia anti-retroviral). Essas imunizações com células dendríticas pareceram ser seguras e resultaram em um aumento da imunidade de células T CD4 e CD8 específicas para o HIV-1.
Esse efeito imunológco foi associado com a diminuição dos níveis de RNA do HIV no plasma em quatro de doze sujeitos. Finalmente, Ide e outros administraram células dendríticas cadenciadas com peptídeos do HIV-1 em quatro indivíduos infectados pelo HIV-1 em terapia anti-retroviral que subseqüentemente foram submetidos à interrupção analítica do tratamento. A vacinação com células dendríticas foi segura, com dois dos quatro sujeitos demonstrando significativas respostas de interferon de células T CD8 ao para alguns peptídeos do HIV-1.
Enquanto os métodos de maturação de células dendríticas, antígenos e populações de pacientes desses estudos variaram em comparação àquele em nosso teste clínico, existem similaridades suficientes para concluir, baseado na segurança e no limitado sucesso clínico dessa terapia, que a administração de vacinas com células dendríticas autólogas apresenta uma promessa substancial como estratégia imunoterapêutica para o tratamento da infecção crônica do HIV-1. Nosso teste de fase I demonstrou, num primeiro momento, que a vacinação com células dendríticas autólogas maturadas e cadenciadas com HLA-A2 restrito aos peptídeos do HIV-1 foi executável e segura num conjunto de indivíduos infectados pelo HIV-1 tratados com terapia anti-retroviral. Nós também demonstramos que um significativo aumento na freqüência das células T CD8 responsivas aos peptídeos do HIV-1 foi alcançada em seguida à vacina de células dendríticas cadenciadas com o peptídeo. Nós temos demonstrado que uma alta dose ( de 5 milhões a 10 milhões de células dendríticas) pareceu se mais efetiva do que uma baixa dose (de 1 milhão a 3 milhões de células dendríticas) no aumento das freqüências de células T reativas aos peptídeos do HIV-1.
Foi observada variabilidade inter-intividual significante na resposta imunológica para os peptídeos da vacina, com uma tendência em direção à melhor resposta entre aqueles com mais células T CD4 profundas. Nós não observamos diferenças na imunigenicidade entre as rotas s.c e i.v de administração.
Este estudo foi limitado por uma relativamente pequena amostra que consistiu predominantemente de sujeitos do sexo masculino com restrita escala de idade. Sumariamente, nosso estudo representa um avanço significativo em mostrar que sob condições rigorosamente controladas, doses muito pequenas de um limitado antígeno pode ser imunogênica em um subgrupo de indivíduos, e por isso isso apresenta uma promessa substancial como estratégia imunoterapêutica para a infecção crônica do HIV-1. Estudos adicionais com pontos virológicos são urgentemente necessários para avaliar combinações alternativas de antígenos em células dendríticas e aumentar nossa compreensão dos mecanismos responsáveis pela variabilidade da resposta imunológica entre os individuos.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Carol Oriss, Chris Tripoli, and Pat Paulson for their
invaluable work coordinating this study. Thanks also go to Joanna
Stanson, Toni Temples, and the entire IMCPL staff for product preparation
and outcome analysis. We express our sincere appreciation for
the generosity and dedication of our study volunteers.
This work was supported by NIH grants PO1-AI55794 and PO1-
DE12321 and NIH/NCRR/GCRC grant M01-RR000056.
1556-6811/08/$08.00_0 doi:10.1128/CVI.00221-07
Copyright © 2008, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
Therapeutic Immunization with Human Immunodeficiency Virus Type 1
(HIV-1) Peptide-Loaded Dendritic Cells Is Safe and Induces
Immunogenicity in HIV-1-Infected Individuals_
Nancy C. Connolly,1 Theresa L. Whiteside,4 Cara Wilson,2,3 Venkatswarlu Kondragunta,5
Charles R. Rinaldo,2,6 and Sharon A. Riddler2,6*
Received 31 May 2007/Returned for modification 7 August 2007/Accepted 9 October 2007
A administração de potente terapia anti-retroviral (ART) resulta num dramático declínio da morbideza e mortalidade devida à infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) para a maioria das pessoas tratadas. A iniciação da terapia anti-retroviral é normalmente acompanhada de decréscimo substancial na carga viral do HIV-1 e aumento da contagem de linfócitos TCD4. Estudos com sobrevventes de longo prazo e cm sujeitos tratados durante a infecção aguda demonstram que respostas vigorosas de linfócitos T citotóxicos (CTL) específicos para o HIV-1 e fortes respostas de linfócitos T Helpers 1 (TH1) correlacionam-se com o controle de longo prazo da replicação do HIV-1 na ausência de terapia, resultando em prolongada sobrevivência livre de sintomas.
Desafortunadamente, a limitada restauração de células T-Helpers específicas para o HIV-1 e a reatividade das CTLs em pessoas com infecção crônica do HIV-1 em terapia anti-retroviral comanda a terapia vitalícia e geralmente persistente, não obstante o baixo nível da replicação viral. Enquanto as respostas imunes inata e adquirida parecem ser responsáveis pelo controle inicial da viremia na infecção aguda do HIV-1, a ocorrência de respostas imunes naturalmente parece enfraquecer sobre o tempo na maioria dos indivíduos infectados, resultando na progressão da doença.
Indivíduos infectados pelo HIV-1 em terapia anti-retroviral com supressão da carga viral plasmática progressivamente perdem as células T citotóxicas específicas para o HIV-1, sugerindo que a viremia persistente é requerida para as altas freqüências de células T citotóxicas específicas para o HIV-1. Na infecção crônica do HIV-1, a descontinuidade da terapia anti-retroviral tem sido uniformemente acompanhada de um rápido retorno de RNA do HIV-1 no plasma correspondente ao pré-tratamento, níveis estáveis de estado, indicando a persistência do reservatório do HIV e ausência de controle imune. Por estas razões, estratégias imunoterapêuticas com o potencial de suprimir a replicação viral e com a meta de elicitar ampla, robusta e durável resposta de TH1 e CTLs específicas para o HIV-1 são necessárias.
Células dendríticas (DC) são conhecidas por desempenhar um crítico papel na geração de respostas imunes altamente específicas contra uma variedade de patógenos. As DC adquirem antígenos na periferia e, no momento de ativação apropriada, migram para os linfonodos, onde elas iniciam a geração de respostas de células TCD4 e TCD8 antígeno-específicas. As DC tem sido extensivamente usadas como adjuvantes e carregadoras de antígenos nas estratégias vacinais para uma variedade de enfermidades, malignidades primárias, para induzir as respostas de células T antígeno-específicas com pequena ou nenhuma toxidade.
Nós e outros propusemos que células dendríticas expressando antígenos poderiam ser uma efetiva imunoterapia para a infecção do HIV-1. Para testar este de conceito, num estudo seguro de fase I, nós usamos células dendríticas autólogas (da própria pessoa) carregadas com peptídeos de CTLs restritos ao HLA*A0201, imunodominante, incluindo três diferentes peptídeos do HIV-1 e um peptídeo da proteína matrix de um único vírus influenza A para imunização. Vacinas baseadas em peptídeos são limitadas pela necessidade de especificidade para o HLA (o alelo do HLA pode não reagir ao peptídeo).
Por isso nós escolhemos para este estudo três peptídeos de HIV-1 CTL que representam um subconjunto seleto de peptídeos do HIV-1 de síntese altamente conservada os quais foram derivados de três proteínas estruturais principais do HIV-1 (Env, Gag e Pol. OBS.: as mesmas usadas na vacina do Dr. Luis Cláudio Arraes) e que exibiram reação cruzada com o complexo maior de histocompatibilidade ligando-se à família supertipo HLA-A2. Cada um desses peptídeos-epítopos de HIV-1 CTL induz a recuperação de respostas de CTLs nos indivíduos infectados pelo HIV-1. O peptídeo 58-66 (do aminoácido 58 ao 66) da proteína matrix do vírus influenza A representa um epítopo dominante reconhecido pela maioria dos indivíduos positivos para o HLA*A0201. Isso tem sido seguramente e efetivamente usado como um imunógeno em numerosos estudos de vacinação. Aqui nós apresentamos os resultados dos testes clínicos da fase I designada para avaliar a segurança e a executividade de células dendríticas autólogas carregadas com peptídeos sintetizados do HIV-1.
MATERIALS AND METHODS ...
RESULTADOS
Praticipantes do estudo.
As característcas da linha de base desse estudo de população estão listadas na Tabela 1. Os sujeitos estudados foram na maior parte homens (15/18) e brancos (16/18), com idade média de 44 anos. A média de contagem de células TCD4, da linha de base foi de 645 células por milímetro cúbico (ml), e profundeza da média de células TCD4 foi 259 células por mm3 (n_17); seis sujeitos tiveram contagem de células TCD4 profundas de 150 células/mm3, e um sujeito não contagem de células TCD4 profundas em valor avaliável. Todos os sujeitos completaram ao todo 24 semanas de acompanhamento; um deles retirado em acordo (após 24 semanas) e um segundo faleceram devido a causas não informadas nesse estudo vacinal (40 semanas).
Segurança.
As imunizações com peptídeos do HIV de células dendríticas autólogas foram em geral seguras e bem toleradas. Dezessete indivíduos receberam ambas as doses da vacina. Um deles (alta dose, s.c) experimentou um grau de febre 3 nunca registrado (1040F) no dia seguinte à primeira vacinação, o que foi considerado relativo à vacina, e na segunda vacina retido. Nenhum outro evento de graduação de 3 ou 4 laboratorial ou clínico informado nesse estudo foi observado. A contagem de células TCD4 permaneceu estável e as cargas virais permaneceram suprimidas em menos de 50 cópias/ml durante o acompanhamento.
A produção da vacina.
Um indivíduo (de baixa dose, i.v.) foi incapaz de suportar leucaférese (um procedimento em que os leucócitos são removidos do sangue coletado e o restante do sangue é retransfundido para o doador) devido a irreularidades anatômicas. Para este indivíduo, células dendríticas abundantes foram obtidas a partir de 100 ml de sangue periférico retiradas uma semana antes de cada dose vacinal. Para os sujeitos remanescentes, as células dendríticas substanciais foram geradas de um único produto de leucaférese para permitir a preparação das múltiplas doses vacinais. As células dendríticas geradas dos participantes do estudo eram similares às células dendríticas obtidas de um grupo de pessoas voluntárias (controle) não infectadas com respeito ao rendimento, viabilidade, pureza e fenótipo (tabela 2) (descritos em mais detalhes adiante). O rendimento principal foi de 9.1_107 (raio de ação 1.3_107 para 2.7_108) para o grupo de controle não infectado. A viabilidade principal e a pureza foram 93% (alcance 69 a 99%) e 100% (alcance 47% para 100%), respectivamente, comparada com 90% (alcance, 85% para 95%) e 77% (alcance, 75% para 89%) para o grupo de controle não infectado. A produção de IL-12p70, uma medição da função das células dendríticas, foi variável mas estatisticamente não diferente daquela dos doadores normais. Não houve estatisticamente diferenças significativas entre as características fenotípicas das células dendríticas imaturas ou de mDC (células dendríticas maduras) geradas de monócitos dos 18 participantes do estudo com infecção crônica do HIV-1 e as dos 15 doadores normais, como demonstrado previamente.
Respostas imunológicas.
Na linha de base, 9 dos 18 indivíduos tiveram respostas para um ou mais peptídeos do HIV-1, e 12 dos 18 tiveram resposta ao peptídeo da proteína matrix do vírus A. Três indivíduos tiveram respostas significativas para todos os quatro peptídeos. Seguindo a vacinação, em agregamento, aumentos estatísticamente significativos na freqüência de células TCD8 respondedoras ao Gag do HIV-1 (P_0.02) e ao Pol do Hiv-1 (P_0.04) foram observadas na sexta semana. Nenhuma diferença significativa foi observada entre as rotinas de administração i.v. e s.c. Uma diferença significativa foi observada entre as doses alta e baixa na quarta semana para o Env do HIV-1 (P_0.04), e uma tendência em direção à resposta significativa foi observada na quarta semana para Gag (P_0.07) e nas sexta (P_0.1) e oitava (P_0.05) semanas para o Pol do HIV-1. As variabilidades interindividuais consideráveis foram registradas no aumento geral de respostas de células TCD8, e o resultado significativo foi atribuível à fortes respostas vistas com células de alguns indivíduos. Finalmente, nós investigamos o efeito de pré-ART CD4 (CD4 profundas anti-retrovirais anteriores à terapia) profundas através do agrupamento de pacientes baseado por suas CD4 profundas (150 versus 150 células /mm3). Uma tênue tendência em direção à mais imunogenicidade no grupo com mais células CD4+ profundas foi observada, particularmente na sexta semana para o Env do HIV-1 (P_0.1), mas diferenças muito significativas não foram notadas.
Discussão.
Neste estudo, nós demonstramos que a vacinação com células dendríticas autólogas cadenciadas com HLA-A2 restrita aos peptídeos do HIV-1 foi segura e executável na infecção crônica pelo HIV-1, em sujeitos tratados com terapia anti-retroviral (ART). Além disso, embora somente duas vacinas tenham sido dadas, a geração de respostas imunológicas específicas ao HIV-1 foram observadas na situação da infecção crônica por HIV-1.
A vacinação com base em células dendríticas representa uma ferramenta potencialmente promissora para aumentar a resposta imunológica do portador contra a infecção pelo HIV-1. Esse estudo representa a maior e mais completo teste descrito de vacinação com células dendríticas autólogas em indivíduos tratados com ART e determina fundamentalização para futuros testes de aumento imunogênico utilizado em terapias baseadas na imunidade. Terapias de base imunológica nesta população tem o potencial de ser uma adição crucial avaliável para a terapia anti-retroviral corrente desde que nós nos empenhemos para a cura mais do que meramente o tratamento da infecção por HIV-1. A despeito de anos de pesquisa, permance desconhecido se a manipulação da imunidade é segura e se pode diminuir a viremia e aumentar o controle imunológico em pessoas infectadas cronicamente pelo HIV-1. Nosso teste examinou a segurança e a eficácia de uma terapia vacinal em sujeitos infectados pelo HIV-1 em terapia anti-retroviral.
Os resultados desse estudo assim como caracterização adicional das propriedades das células dendríticas dos participantes do estudo na linha de base indicaram que células dendríticas derivadas de monócitos obtidas por leucaférese de sujeitos infectados cronicamente pelo HIV-1 com carga viral suprimida foi, com poucas exceções, fenotipicamente e funcionalmente comparável às células dendríticas de doadores normais.
As seleções de antígenos e adjuvantes são de importância crucial em todas as estratégias vacinais. O uso de células dendríticas como adjuvante para vacinação foi largamente desenvolvido em testes contra o câncer, em que o uso de peptídeos sintéticos como antígenos tem muitas vantegens: eles são relativamente fáceis de produzir, são hábeis para o monitoramento de respostas celulares peptídeo-específicas, eles excluem a possibilidade de infecção por produto vacinal, e eles minimizam o risco de geração de imunidade contra antígenos próprios. Por essas razões, os peptídeos sintéticos específicos do HIV-1 foram escolhidos para esta fase I de estudo de segurança e executabilidade de imunização baseada em células dendríticas nesse grupo tratado com terapia anti-retroviral. Permanece desconhecido, e é um assunto para mais estudos, qual emergirá como um antígeno ótimo para vacinação contra o HIV-1, enquanto terapia ou profilaxia. Aqui nós demonstramos que a administraação de somente duas doses de células dendríticas expostas a peptídeos sintéticos, embora com relativamente limitada especificidade, representa uma estratégia imunogênica potencial e executável.
A marca das estratégias imunoterapêuticas para infecção por HIV-1, i.e., para diminuir a carga viral e aumentar a contagem de células CD4, é conhecida através de anos de testes clínicos e observações correlatas com decréscimo da morbidade e da mortalidade resultante da infecção por HIV-1. Esse estudo não foi designado nem atribuído para detectar uma respota imunológica ou clínica. A despeito disso, nós demonstramos não somente que as cargas virais e a contagem de CD4 permaneceu inalterada, mas que certamente os indivíduos apresentaram aumento em sua resposta de células T CD8 específica para peptídeos do HIV-1.
Os resultados de outras três fases I de testes baseadas em imunização terapêutica com células dendríticas autólogas foram publicados recentemente. Lu e outros (Lu, W., L. C. Arraes, W. T. Ferreira, and J. M. Andrieu. 2004. Therapeuticdendritic-cell vaccine for chronic HIV-1 infection Nat. Med. 10:1359–1365) usaram células dendríticas autólogas cadenciadas com HIV-1 autólogos inativados em 18 sujeitos brasileiros naïve (não expostos) ART (à terapia anti-retroviral). Essas imunizações com células dendríticas pareceram ser seguras e resultaram em um aumento da imunidade de células T CD4 e CD8 específicas para o HIV-1.
Esse efeito imunológco foi associado com a diminuição dos níveis de RNA do HIV no plasma em quatro de doze sujeitos. Finalmente, Ide e outros administraram células dendríticas cadenciadas com peptídeos do HIV-1 em quatro indivíduos infectados pelo HIV-1 em terapia anti-retroviral que subseqüentemente foram submetidos à interrupção analítica do tratamento. A vacinação com células dendríticas foi segura, com dois dos quatro sujeitos demonstrando significativas respostas de interferon de células T CD8 ao para alguns peptídeos do HIV-1.
Enquanto os métodos de maturação de células dendríticas, antígenos e populações de pacientes desses estudos variaram em comparação àquele em nosso teste clínico, existem similaridades suficientes para concluir, baseado na segurança e no limitado sucesso clínico dessa terapia, que a administração de vacinas com células dendríticas autólogas apresenta uma promessa substancial como estratégia imunoterapêutica para o tratamento da infecção crônica do HIV-1. Nosso teste de fase I demonstrou, num primeiro momento, que a vacinação com células dendríticas autólogas maturadas e cadenciadas com HLA-A2 restrito aos peptídeos do HIV-1 foi executável e segura num conjunto de indivíduos infectados pelo HIV-1 tratados com terapia anti-retroviral. Nós também demonstramos que um significativo aumento na freqüência das células T CD8 responsivas aos peptídeos do HIV-1 foi alcançada em seguida à vacina de células dendríticas cadenciadas com o peptídeo. Nós temos demonstrado que uma alta dose ( de 5 milhões a 10 milhões de células dendríticas) pareceu se mais efetiva do que uma baixa dose (de 1 milhão a 3 milhões de células dendríticas) no aumento das freqüências de células T reativas aos peptídeos do HIV-1.
Foi observada variabilidade inter-intividual significante na resposta imunológica para os peptídeos da vacina, com uma tendência em direção à melhor resposta entre aqueles com mais células T CD4 profundas. Nós não observamos diferenças na imunigenicidade entre as rotas s.c e i.v de administração.
Este estudo foi limitado por uma relativamente pequena amostra que consistiu predominantemente de sujeitos do sexo masculino com restrita escala de idade. Sumariamente, nosso estudo representa um avanço significativo em mostrar que sob condições rigorosamente controladas, doses muito pequenas de um limitado antígeno pode ser imunogênica em um subgrupo de indivíduos, e por isso isso apresenta uma promessa substancial como estratégia imunoterapêutica para a infecção crônica do HIV-1. Estudos adicionais com pontos virológicos são urgentemente necessários para avaliar combinações alternativas de antígenos em células dendríticas e aumentar nossa compreensão dos mecanismos responsáveis pela variabilidade da resposta imunológica entre os individuos.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Carol Oriss, Chris Tripoli, and Pat Paulson for their
invaluable work coordinating this study. Thanks also go to Joanna
Stanson, Toni Temples, and the entire IMCPL staff for product preparation
and outcome analysis. We express our sincere appreciation for
the generosity and dedication of our study volunteers.
This work was supported by NIH grants PO1-AI55794 and PO1-
DE12321 and NIH/NCRR/GCRC grant M01-RR000056.
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