REVIGORAÇÃO DE CÉLULAS t ESPECÍFICAS PARA O HIV EXAUSTAS, POR MEIO DO BLOQUEIO DE LIGANTES PD-1-PD-1
Gordon J. Freeman, E. John Wherry, Rafi Ahmed, e Arlene H. Sharpe

A morte programada (PD)-1-PD-1 pela via do ligante (PD-L), a qual é parte da família B7-CD28, consiste do receptor de PD-1 e de seus ligantes PD-L1 e PD-L2. O casamento do PD-1 com seus ligantes inibe as respostas imunes, e um trabalho recente demonstra que o PD-1 é altamente expressivo em células T exauridas durante a coriomeningite linfocítica crônica viral (LCMV) em camundongos infectados. O bloqueio dessa via revigora as células T exaustas, permitindo sua expansão e produção de citocinas efetoras, levantando a questão sobre se este caminho tem sido explorado por uma variedade de viroses durante a infecção crônica. Novos estudos agora estendem essas observações para a infecção por HIV e doenças humanas.

EXPRESSÃO DE PD-1 E SINALIZAÇÃO

PD-1 foi isolado como um gene sobre-regulado (regulado para mais) em uma célula T de hibridoma [tumor de células híbridas utilizado na produção “in vitro” de anticorpos monoclonais específicos; produzido pela fusão de uma linhagem de cultura tecidual estabelecida de células tumorais linfocitárias (p.ex. células do plasmocitoma de camundongos) e células produtoras de anticorpos específicos (p. ex. espemócitos de camundongos especificamente imunizados); as fusões são obtidas com o uso de polietilenoglicol ou outros métodos. Dic.Stedman] sofrendo morte celular por apoptose. PD-1 (CD279) é expressada por indução em células TCD4, TCD8, NKT, células B, monócitos no momento de ativação . Esta ampla expressão de PD-1 contrasta com a supressão de CD28 e CTLA-4 em células específicas. [CTLA4 é um membro da superfamília de imunoglobulinas e é uma molécula co-estimuladora expressada por células T ativadas. CTLA4 é similar ao co-estimulador de células T CD28, e ambas moléculas ligam B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86) em células apresentado antígenos. CTLA4 transmite um sinal inibitório para as células T, enquanto CD28 transmite um sinal estimulador em células T específicas. (OMIM 123890)]. PD-1 transduz (conduz um sinal energético) um sinal quando engatada em combinação com ligação de receptor da família CD28. O domínio citoplasmático de PD-1 contém dois motivos de sinalização de tirosina ambos os quais podem ser fosforilados sobre a combinação com o receptor. A fosforilação da segunda tirosina, um imuno-receptor com motivo de interruptor baseado em tirosina, recruta a tirosina fosfatase SHP-2 e em menor volume SHP-1 para o domínio ctoplasmático de PD-1. [SMALL HETERODIMER PARTNER; SHP; SHP1 – a superfamília de receptores nucleares é um grupo de fatores de transcrição regulada por pequenos hormônio hidrofóbicos como os ácidos retinóicos, hormônio da tiróide e esteróides. Essa superfamília também inclui receptores nucleares órfãos, como NR0B2, os quais são proteínas relatadas que não tem ligantes conhecidos(OMIM 604630)] O recrutamento dessas fosfatases leva à desfosforilação do TCR próximo sinalizando moléculas, inclusive ZAP70, PKCθ e CD3’ζ , levando à atenuação do sinal TCR/CD28. A sinalização de PD-1 impede a ativação de quinases 3 fosfatidilinositol mediada por CD28, resultando em redução da fosforilação de AKT e do metabolismo da glicose.

EXPRESSÃO DE LIGANTES DE PD-1

Os ligantes de PD-1 têm padrões distintos de expressão. PD-L2 (B7-DC; CD273) é expressada por indução somente em células apresentadoras de antígenos profissionais e não profissionais. PD-L1 é constitutivamente expressada em células B, células dendríticas, macrófagos e células T, e é mais sobre-regulada na ativação. PD-L1 também é expressada em uma ampla variedade de tipos de células não hematopoiéticas, incluindo células do endotélio vascular, células do epitélio tubular renal, miocárdio cardíaco, células de ilhas pancreáticas, células gliais no cérebro(glia=neuroglia: neuróglia são elementos celulares não-neuronais dos sistemas nervoso central e periférico; estão invariavelmente interpostas entre os neurônios e os vasos sangüíneos que suprem o sistema nervoso. Dic.Stedman), músculo inflamado e queratinócitos (células da epiderme e do epitélio oral). Os interferons α,β e y (alfa, beta e gama) são poderosamente sobre-reguladores da expressão de PD-L1 em células apresentadoras de antígenos, células do endotélio e células epiteliais. Durante as respostas pró-inflamatórias imunes, tal como infecção e rejeição a transplantes, a expressão de PD-L1 é intensa e extensiva. Por exemplo, PD-L1 é expressada nas células de Kupffer do fígado e é sobre-regulada (regulada para mais) em hepatócitos após a infecção por hepatite B. PD-L1 também é expressada em sítios de privilégio imune tal como a placenta e os olhos. A expressão de PD-1 é encontrada em muitos tumores sólidos, e alta expressão de PD-L1 está associada com pobre prognóstico.

A EXAUSÃO VIRAL E A VIA DE PD-1-PD-L.

Células T CD8 antivirais efetoras possuem variadas propriedades funcionais incluindo a produção de citocina (e.g., IFN-y, TNF-α, IL-2), com potencial citotóxico (e.g., exocitose[processo pelo qual são liberados grânulos ou gotículas secretoras de uma célula; a membrana ao redor do grânulo se funde com a membrana celular, que se rompe, e a secreção é liberada. Dic Stedman]dos grânulos de perforina e granzime [perforina é uma proteína encontrada nos grânulos citoplasmáticos de linfócitos T citotóxicos e das células exterminadoras naturais (células natural killer). Esta proteína está envolvida na lise de células-alvo pelas células NK]{granzime= protease com atividade serina esterase que representa a maior parte do conteúdo dos grânulos das células T citotóxicas. Não se sabe de as células T citotóxicas precisam dessas enzimas para matar. Dic.Stedman}, alto potencial proliferativo, baixa apoptose, e para células de memória, a habilidade de auto-regeneração por via de retorno homeostático. Um dos fatores-chave de células TCD8 de memória é a habilidade para rapidamente reativar múltiplas funções efetoras e promover vigorosa proliferação após a re-exposição ao antígeno. Em contraste com a alta capacidade funcional de células TCD8 efetoras e de memória após aguda infecção ou vacinação, a função de células TCD8 é muitas vezes reduzida ou exaurida durante infecções crônicas. A exaustão foi originalmente descrita durante infecção crônica por LCMV como a persistência de células TCD8 vírus-específicas sem funções efetoras. A exaustão de células TCD8 pareceu ser uma notória característica não somente de infecções crônicas experimentais em camundongos, mas também durante infecções crônicas em primatas e humanos. Por exemplo, células TCD8 antígeno-específicas não funcionais têm sido observadas durante a infecção por SIV em primatas e infecção por HIV, hepatite B, hepatite C em humanos e no vírus linfotrópico T humano de tipo 1 (vírus com tropismo para linfócitos T humanos).
Estudos de ambos modelos de infecção crônica no camundongo e em humanos tem demonstrado que a exaustão compreende uma gama de disfunções de relativamente médias ao extremo. Potencial proliferativo reduzido é uma característica chave de exaustão que freqüentemente ocorre quando outras funções tais como produção de citocinas estão em grande parte intactas. De fato, o alto potencial proliferativo correlaciona-se com a não progressão durante a infecção por HIV e pode ser uma propriedade decisiva para aquelas células T que podem responder à intervenção terapêutica. Nesse ponto parece haver uma distinta hierarquia de exaustão com certas propriedades funcionais, tal como produção de IL-2 e potencial proliferativo, as quais são perdidas primeiro, e outras funções, como produção de IFN-y, que são mais resistentes `a inativação. A duração da infecção, nível de exposição ao antígeno, e a avaliabilidade de células TCD4 salvadoras (helper) são fatores cruciais que afetam o nível de exaustão durante uma dada infecção crônica.
O tipo e a qualidade das APC (células apresentadoras de antígeno) também pode mudar dramaticamente durante infecções crônicas como, por exemplo, APCs profissionas são mortas e os sinais inflamatórios mudam. É plausível que esse repertório de APCs alteradas e mudanças associadas à co-estimulação venham influenciar a exaustão das células T durante as infecções crônicas. Durante a infecção por HIV, a expressão superficial de PD-L1 em células apresentadoras de antígenos é aumentada e a expressão de CD86 (B7-2) é diminuída, tipificando o balanço entre sinais inibidores e estimuladores entregues às células T em favor da inibição. Adicionalmente, os sinais inibitórios entregues por PD-L1 em células epiteliais e endoteliais podem assumir/aceitar significância adicional quando APCs profissionais são reduzidas durante a infecção crônica.
Estudos recentes têm mostrado que PD-1 é altamente expressada por células TCD8 durante a infecção crônica por LCMV e que o caminho PD-1-PD-L exerce um papel principal na regulação da exaustão de células T durante esta infecção. Quand anticorpos foram usados para bloquar o caminho PD-1-PD-L “in vivo” durante a infecção crônica por LCMV, as respostas de células TCD8 vírus-específicas foram potencialmente aumentadas. Não somente foi o número de células TCD8 específicas para LCMV que expandiu dramaticamente, mas suas funções também foram aperfeiçoadas. Após o bloqueio PD-1-PD-l “in vivo”, as células TCD8 vírus-específicas produziram mais IFN-y e TNF-α em uma base por célula. A conseqüência dessa exaustão de células TCD8 vírus-específica revertida foi uma considerável redução na carga viral. Este estudo preparou o estágio para investigação sobre a expressão de PD-1 e o possível controle da exaustão de células T pelo caminho da PD-1-PD-L, durante a infecção viral crônica humana.

A VIA PD-1-PD-L NA INFECÇÃO POR HIV

Varios estudos novos sugerem um papel para a via PD-1-PD-L em células TCD8 vírus-específicas examinadas durante a infecção por HIV. O estudo por Petrovas e outros sobre este tema, e estudos de Day e outros e Trautmann e outros publicados recentemente no Nature e Nature Medicine respectivamente, demonstraram que a expressão de PD-1 é elevada em células TCD8 específicas para o HIV e que o bloqueio da via PD-1-PD-L leva ao aumento da proliferação de células T e da produção de citocinas efetoras. Trabalhos prévios demonstraram que PD-L1 é sobre-regulada na infecção por HIV. Coletivamente, essas observações sugerem que a via PD-1-PD-L pode realmente ser operante durante a infecção crônica por HIV.
Uma grande porcentagem de células TCD8 específicas para o HIV expressou PD-1 e a expressão desse receptor foi elevada em uma base por célula. Uma grande proporção de células TCD8 específicas para o HIV também expressou CD27 e CD45RO, indicando uma ativação prévia. Essas células TCD8 perderam a expressão do receptor co-estimulador CD28 e de perforina e expressavam somente duas posições de CCR7 e CD127 (receptor alfa de IL-7), as quais são importantes moléculas para a manutenção de células T de memória. Este fenótipo sugere que as células T são pobremente funcionais, não estão se transformando em células de memória e são particularmente receptivas aos sinais inibidores.
Células TCD8 em indivíduos infectados com HIV tem previamente sido apresentadas por serem disfuncionais com reduzida capacidade proliferativa e função efetora. Day e outros demonstraram que a severidade da doença, como julgada pela carga viral e declínio de contagem de CD4, era correlacionada com ambos os níveis de expressão de PD-1 nas células TCD8 específicas para o HIV e a porcentagem de células expressando PD-1, proporcionando um marcador em células TCD8 que se correlaciona com a severidade da doença. O nível de expressão de PD-1 também foi associado com o decréscimo de proliferação de células TCD8 em resposta a uma estimulação com antígeno de HIV “in vitro”. Coletivamente, esses achados demonstram que o nível de PD-1 é correlato à extensão de exaustão das células T. Day e outros e Trautmann e outros demonstraram além disso que a expressão de PD-1 em células TCD8 específicas para o HIV foi reduzida em pacientes passando por terapia anti-retroviral altamente ativa , consistentemente com a noção de que altos níveis de antígenos dirigem a expressão de PD-1 e a exaustão funcional. De acordo com Trautmann e outros, a disfunção de CD8 não resulta de alterações na expressão de TCR (receptor de célula T) ou da estimulação com peptídeos ligantes alterados.
Existem diferenças surpreendentes nos níveis de expressão de PD-1 nas células T vírus-específicas em infecções crônicas em oposição às infecções resolvidas. Células T específicas para o vírus de vacínia, o qual causa uma aguda infecção de limitação ao próprio, expressaram pouco PD-1 comparadas com os altos níveis de expressão de PD-1 expressado por células T específicas para HIV. Em contraste, células T específicas para viroses crônicas, CMV e vírus Epstein Barr, expressaram níveis de moderados para altos de PD-1, respectivamente. Isso sugere que a viremia sustentada e a apresentação de antígeno mantém os altos níveis de expressão de PD-1. Isso será importante para determinar se a sobre-regulação de PD-1 e PD-L é uma conseqüência da resposta anti-viral do interferon, e efeito indireto da ativação de células T e produção de citocinas anti-inflamatórias, ou se as proteínas do HIV sobre-regulam diretamente sua expressão.
Todos os três papéis (publicações referidas) demonstram a significância funcional da expressão de PD-1 em células T específicas para o HIV. O bloqueio de PD-L1 com um anticorpo monoclonal leva ao aumento da proliferação de células T e à produção de TNF-α, IFN-y e ganzime B, indicando um acréscimo geral da função efetora. Embora o bloqueio do curto termo da via PD-1-PD-L em um ensaio de citocina 6-h tenha tido pouco efeito na função das células TCD8 específicas para o HIV, o bloqueio desta via durante o ensaio de proliferação 6 d aumentou a proliferação de ambas as células TCD8 e TCD4 específicas para o HIV e resultou em células T mais funcionais no final da cultura. Se a proliferação é um pré-requisito para a recuperação de outras funções de células T isso permanece por ser determinado. A atividade citolítica, por exemplo, não foi examinadae será de grande interesse. Também não foi esclarecido se a recuperação do potencial proliferativo observado nos sistemas LCMV e HIV refletem crescimento na divisão celular, menos morte ou ambos.
Petrovas e outros, usaram uma lâmina ligada com anticorpo policlonal específico para PD-1 para demonstrar o relacionamento entre a redução de PD-1 com a proliferação de células T antígeno-específicas do HIV. Eles examinaram a apoptose CE células TCD8 específicas para o HIV com PD-1 + (ativa?) e acharam aumentos em ambas apoptose espontânea e mediada por Faz, sugerindo que uma comunicação cruzada pode ocorrer entre o PD-1 e os receptores de Faz. A interpretação desses achados, entretanto, é complicada pela descoberta de que células TCD8 específicas para o HIV com PD-1 negativa (inativa?) também tiveram a suscetibilidade para apoptose aumentada. É possível que outros fatores tal como níveis de ativação de células T estejam envolvidos. Células expressando níveis muito altos de PD-1 foram muito mais suscetíveis para sinais de morte, sugerindo que a expressão de PD-1 leva a um defeito de sobrevivência “in vivo”.
Por motivo da conexão entre CD4 de salvamento (helper) e a função de CD8, Day e outros também examinaram os efeitos do bloqueio a ligantes de PD-1 na expansão de células TCD4. Notavelmente, em cinco dos seis pacientes com indetectáveis respostas ao antígeno p24 do HIV por TCD4 proliferativas, o bloqueio de PD-L1 restaurou vigorosamente a expressão de células TCD4, sugerindo que as células TCD4 específicas para o HIV podem estar presentes, mas, funcionalmente diminuídas de tal modo que elas são indetectáveis em ensaios criteriais.

INFECÇÕES QUE UTILIZAM-SE DA VIA PD-1-PD-L

Em adição ao HIV e LCMV, uma variedade de micróbios patogênicos parece ter usurpado a via da ligação PD-1-PD-L para inibir a imunidade antimicrobial e o dano ao tecido do hospedeiro mediado pela imunização. Durante as infecções crônicas virais e infcções por parasitas, a sobre-regulação de PD-l e seus ligantes pode atenuar as respostas imunes e facilitar a persistência de patógenos. Por exemplo, a expressão de ligantes PD-1 é requerida para a função supressora de macrófagos e a indução de anergia [1. Ausência de capacidade de gerar uma reação de sensibilidade às substâncias esperadas como sendo antigênicas (imunogênicas e alergênicas) em determinado indivíduo. 2. Falta de energia. dic Stedman.] em células T durante infecções com helmintos Schistomosa mansoni e Taenia crassiceps. A sobre-regulação de PD-1 e seus ligantes também deve ser usada para limitar conseqüências inflamatórias com potencial pernicioso de respostas efetoras anti-microbiais. Tal como o papel promotor de PD-1 é sugerido por estudos de camundongos infectados com adenovírus PD-1-/-, os quais mais rapidamente expulsam o vírus mas desenvolvem danos hepatocelulares mais severos do que os camundongos de tipo selvagem.

CONSIDERAÇÕES E QUESTÕES NÃO RESOLVIDAS

A via PD-1-PD-L tem um papel crucial na regulação do balanço entre a ativação de células T e a tolerância. Bloqueio ou eliminação de PD-1 e seus ligantes pode acelerar e exacerbar doenças auto-imunes. O polimorfismo em um único nucleotídeo de PD-1 tem sido relacionado com muitas doenças auto-imunes, embora como o PD-1 afeta a suscetibilidade para doenças auto-imunes humanas não esteja claro. Será importante aprender como regular/ajustar esse caminho para reativar células T ao mesmo tempo minimizando o risco de auto-imunidade e imunopatologia.
Como PD-1 exerce seus efeitos inibidores? Muitos artigos tem mostrado que a sinalização de PD-1 inibe a ativação de células T. Relatórios iniciais descobriram um resultado/uma conseqüência da captura do ciclo celular além da morte celular, mas estudos recentes, incluindo o estudo de Petrovas e outros, enfatiza o papel de PD-1 em promover a morte de células T. PD-1 deve engajar diretamente uma via de morte ou mais aceitavelmente indiretamente influenciar a morte celular por sub-regulação (regulação para menos) de sinais de sobrevivência efetores e de crescimento ou sinergizando com vias de morte. Por exemplo, a ligação PD-1 inibe a expressão do gene bcl-xl de sobrevivência da célula e de vários fatores de crescimento. Os efeitos de ligação de PD-1 na expressão de receptores de morte e de vias de morte devem ser mais estudados.
As conseqüências de interações de PD-1-PD-L na expansão e sobrevivência de células T também dependem do micro-evolvimento e do tipo das APCs (células apresentadoras de antígenos) que interagem com as células T. Quando macrófagos são usados como APCs, os anticorpos monoclonais anti-PD-L1 ou anti-PD-1 aumentam a produção de IFN-y e IL-2 por células T, mas, paradoxalmante, inibem sua proliferação. Essa inibição foi causada pela produção de óxido nítrico pelos macrófagos que é dependente da indução por IFN-y, o qual (óxido nítrico de macrófagos) inibe a proliferação de células T.(Obs.: o IFN-y é produzido pelas células NK e outras talvez.)O aumento da produção de INF-y após o bloqueio de PD-L1 é visto em células T específicas pelo HIV e é um resultado comumente relatado em muitos sistemas experimentais. Assim, a combinação do bloqueio da sintetase de NO (óxido nítrico) induzido com o bloqueio de PD-1-PD-L pode ser um potencial terapêutico como um método para aumentar a resposta imune e proteger contra processos anti-inflamatórios potenciais resultantes do NO.
Para otimizar a manipulação dessa via durante a infecção viral crônica, trabalhos adicionais são necessários para compreender as funções de PD-L1 versus PD-L2, e o papel de PD-1 em células B e macrófaos e nas células T. Desde que PD-1 é expressada em células B e macrófaos e que é expressada em células T, deve haver também uma sinalização bi-direcional. Algusn relatórios descrevem a sinalização revertida de PD-L1 e PD-L2 dentro das células que as expressam. Também existem dados que sustentam que funções estimuladoras de PD-L1 e de PD-L2 sejam, possivelmente, mediadas por um segundo receptor ainda não identificado. As contribuições de cada uma dessas interações para eficácia terapêutica da manipulação dessa via precisam ser avaliadas.

CONCLUINDO OBSERVAÇÕES

Os relatórios de Petrovas e outros, Day e outros e Trautmann e outros sugerem que o bloqueio da interação PD-1-PD-L pode ser uma estratégia terapêutica para a infecção por HIV que pode permitir a reativação de respostas de células T anti-HIV. Porque esta via tem um importante papel na regulagem do balanço entre a ativação de células T e a tolerância, será importante identificar o momento ótimo e a freqüência da terapia para minimizar o risco de imunopatologias ou auto-imunidade. Os efeitos do bloqueio de somente PD-1, PD-L1 ou PD-L2 ou a combinação dos três será necessariamente avaliada por eficácia e segurança. Deverá ser benéfico cominar o bloqueio de PD-1 com a terapia anti-viral ou vacinação terapêutica. Em particular, desde que os efeitos terapêuticos de interferons sejam limitados pela indução de ligantes de PD-1, pode haver benefícios sinergéticos no bloqueio de PD-1 em conjugação com terapia com interferon. Estudos adicionais são necessários para investigar a estenção pretendida, e por quanto tempo, o bloqueio de PD-1-PD-L pode restaurar diferentes funções efetoras, particularmente a citólise (lise celular).
Gordon J. Freeman, E.John Wherry, Rafi Ahmed, e Arlene H. Sharpe
Rockfeller Press, 2 de outubro de 2006.

RESPOSTA IMUNE ESPECÍFICA AO HIV-1

Alexandre Harari e Giuseppe Pantaleo

(Capítulo do livro: HIV-1 MOLECULAR BIOLOGY AND PATHOGENESIS)

Tradução: Isabela Matheus


1.INTRODUÇÃO

O sistema imune inato representa a primeira linha de defesa contra a invasão de microorganismos, e existe uma crescente evidência de que a interação inicial entre microorganismos invasores e o sistema imune inato molda substancialmente o desenvolvimento da imunidade adaptativa. Entretanto, a proteção contra infecções virais é predominantemente mediada pela imunidade adaptativa e por ambas imunidades mediada por células e humoral. O efeito antiviral da imunidade humoral é mediado através da geração de anticorpos capazes de bloquear a entrada / infecção do vírus em células marcadas (alvo). Esses anticorpos que bloqueiam a entrada do vírus são conhecidos como anticorpos neutralizantes. Os componentes efetores da imunidade mediada por células, células T CD4 e TCD8, mediam seu efeito antiviral através da secreção de citocinas e da morte de células infectadas pelo vírus marcadas. Existe uma diferença na resposta antiviral entre as imunidades humoral e mediada por células. Anticorpos neutralizantes são críticos na prevenção de infecção viral e têm pouco ou nenhum efeito em controlar infecções crônicas estabelecidas, enquanto as células TCD4 e TCD8 específicas para o vírus não previnem a infecção mas são críticas no controle da infecção crônica.
As viroses humanas mais difusas têm de fato diferentes suscetibilidades para componentes efetores das imunidades humoral e mediada por células baseada em suas habilidades para persistir e estabelecer a infecção crônica. Exemplos de viroses que são rapidamente expulsas pela resposta imune durante a infecção primária incluem o vírus influenza, póliovírus, vírus measles, da rubéola, poxvírus (da varíola), vírus da hepatite A, e vírus da febre amarela (Arvin, 1996; Griffin, 1995; Pantaleo e Koup, 2004). O HIV-1 pertence à classe das viroses tal como citomegalovírus (CMV), vírus Epstein-Barr (EBV), vírus do herpes simples (HSV), vírus da hepatite B (HBV) e viroses C (HVC), vírus da varicela zoster (VSV), e vírus do papiloma humano (HPV) que persistem em infecções crônicas estabelecdas. (Bertoletti e Ferrari, 2003; Callan, 2003; Doherty e outros, 2001; Harari e outros, 2004b; Panteleo e Koup, 2004). A habilidade de certas viroses para estabelecer infecções crônicas resulta de uma variedade de mecanismos que as viroses têm envolvido para evadir à resposta imune do hospedeiro. (Alcami e Koszinowski, 2000; Bechmann e kopf, 1999; Bachmann e Zinkernagel, 1997; Doherty e Christensen, 2000; Mc Michael e Phillps, 1997; Walker e Goulder, 2000; Zinkernagel e ouros, 2001). Os mecanismos de escape imune do vírus operam em dois níveis admitindo ambas a persistência do vírus no momento do primeiro encontro entre o vírus e o hospedeiro e o controle ineficiente da replicação viral durante a infecção crônica estabelecida.
Interessantemente, existe uma diferença substancial na resposta imune para viroses que são eficientemente expulsas durante a infecção primária e crônica (Pantaleo e Koup, 2004). A resposta imune contra viroses que são eficientemente expulsas no momento da infecção primária é predominantemente mediada por anticorpos neutralizantes (Pantaleo e Koup, 2004). Anticorpos neutralizantes também são primariamente responsáveis pela proteção contra infecções seguidas à vacinação. A efetividade dos anticorpos neutralizantes é relacionada à biologia do vírus e ao tipo de infecção. Por exemplo, viroses que são rapidamente expulsas durante a infecção primária geralmente são altamente citopáticas (conferem patologia às células) e induzem morte massiva de células alvejadas e liberam partículas virais que, por sua vez, as tornam suscetíveis à atividade neutralizante dos anticorpos. Essas viroses não são capazes de estabelecer infecções crônicas em células alvejadas e por isso a imunidade mediada por células tem efeito limitado contra essas viroses.
Viroses que estabelecem infecções crônicas são capazes de estabelecer a infecção crônica em células alvejadas e a imunidade mediada por células é uma resposta ótima contra as viroses associadas a células. Os efeitos protetores da neutralização por anticorpos contra viroses associadas a células ainda não está estabelecido.

O presente capítulo focaliza as análises da resposta imune específica ao HIV-1. Em particular, nós analisaremos ambas imunidades humoral e mediada por células específicas para o HIV-1. Com respeito à resposta específica contra o HIV-1 das células T, nós revisaremos as estratégias correntes, fenotípica e funcional, para analisar a resposta de células T específica para o HIV-1, as anormalidades fenotípicas e funcionais observadas nas respostas específicas de células T contra o HIV-1 comparadas com outras infecções crônicas que são eficientemente controladas pela resposta imune, e finalmente, a correlação de imunidade protetora de respostas de células T a vírus específicos.

2.A RESPOSTA HUMORAL ESPECÍFICA PARA O VÍRUS DO HIV-1

Os correlatos imunes de proteção à infecção das vacinas efetivos que têm sido desenvolvidas contra uma variedade de viroses são representados por anticorpos neutralizantes (Letin, 2006; Mc Michael, 2006; Pantophlet e Burton, 2006). Anticorpos neutralizantes tanto previnem infecções como podem efetivamente conter a expansão de infecções seguidas da exposição ao vírus. Eles são predominantemente efetivos contra partículas virais livres enquanto tem limitado efeito contra células infectadas por vírus. (Bachmann e Kopf, 1999; Bachmann e Zinkernagel, 1997; Zinkernagel e outros, 2001). A resposta imune humoral para o HIV-1 é caracterizada pela presença de uma vigorosa resposta de anticorpos contra várias proteínas virais. (Pantophlet e Buron, 2006). A presença de anticorpos contra o HIV-1 é de fato usada como seletores em ensaios laboratoriais para o diagnóstico da infecção por HIV-1. Entretanto, a grande maioria das respostas de anticorpos é composta de anticorpos sem atividade neutralizante.
O papel protetor dos anticorpos neutralizantes na infecção crônica por HIV-1 não está esclarecido. Anticorpos neutralizantes não são encontrados em sujeitos com infecção progressiva enquanto altos títulos (medidas) de anticorpos neutralizantes com nítida atividade neutralizante são encontrados em sujeitos com infecção do HIV-1 não progressiva, que são portadores não progressivos a longo prazo (LTNPs). (Carotenuto e outros, 1998).
Vários estudos têm investigado os mecanismos responsáveis pela pobre resposta neutralizante e para a limitada atividade neutralizante contra os diferentes HIVs isolados inicialmente. Isso é particularmente relevante para o desenvolvimento de vacina. Nesse contexto, vacinas candidatas baseadas em proteínas tem sido usadas para induzir respostas de anticorpos. (Letvin, 2006; Mc Michael, 2006; Pantophlet e Burton, 2006). Entretanto, os resultados obtidos com vacinas individuais que têm sido testadas atualmente na fase III de testes de eficácia clínicos têm sido desapontadoras em termos de magnitude e sobre a atividade neutralizante das respostas de anticorpos elicitadas (que surgiram) (Letvin, 2005). Por isso existem três problemas principais com as respostas de anticorpos induzidas pelas vacinas correntes baseadas em proteínas:
1) pouca magnitude;
2) pobre ou nenhuma atividade neutralizante;
3) falta de atividade neutralizante nítida (específica).
Nesse contexto, é importante mencionar que a atividade neutralizante no soro de pessoas infectadas com o HIV-1 não é detectada até o título de Elisa ser maior que > 1: 100.000. Dois mecanismos. Dois mecanismos principais têm sido propostos para explicar a evasão de anticorpos do HIV-1:

1) a presença de regiões V1-V3 variáveis; e
2) o escudo de glicana (polissacarídeo).

Com respeito ao primeiro mecanismo, tem sido proposto que o sítio de ligação do co-receptor é mascarado (disfarçado) peãs regiões V1-V2. A respeito do escudo de glicana, 50% das glicoproteínas gp120 são cobertas por carboidratos que tornam a superfície das gp120 inacessíveis aos anticorpos.
Por isso, elicitar robustas respostas de anticorpos neutralizantes contra o HIV em particular permanece o principal bloco de tropeços para o desenvolvimento da vacina (Burton e outros, 2004). Somente poucos anticorpos neutralizantes humanos têm apresentado potência suficientemente nítida. Estes anticorpos neutralizantes têm alvejado regiões conservadas das glicoproteínas do envelope do HIV. Os anticorpos neutralizantes IgG1b2 (Burton e outros, 1994) e 2G12 (Trkola e outros, 1996) marcam GP 120, enquanto 2F5, 4E10 e Z13 (e Z13i) alvejam uma região externa proximal à membrana (MPER) da glicoproteína gp41. (Buchacher e outros, 1994; Muster e outros, 1993; Purtscher e outros, 1994; Stiegler e outros, 2001; Zwick e outros, 2001). Uma série de observações têm claramente demonstrado que estes anticorpos são protetores. Primeiro, tem sido demonstrado que a transferência passiva de anticorpos neutralizantes pode proteger completamente contra a ameaça de lentivírus em primatas não humanos (Zwih e outros, 2005). Segundo, um importante achado em recente estudo clínico tem demonstrado que a administração de uma alta dose combinada (coquetel) de 2F5, AE10 e 2G12 pode retardar significativamente a repercussão após a cessação da terapia antiviral demonstrando potencial protetor da resposta humoral .(Trkola e outros, 2005). Esses achados demonstram que os epítopos alvos são de fato presentes nos envelopes virais circulantes e sugerem que um deles poderia ser capaz de induzir anticorpos neutraliantes para este e outros epítopos se estratégias apropriadas de imunização fossem empregadas.

3. RESPOSTAS ESPECÍFICAS DAS CELULAS T AO HIV-1

A- O PAPEL PROTETOR DE RESPOSTAS DE CÉLULAS T ESPECÍFICAS PARA O HIV-1
Um grande número de estudos defendem vigorosamente o papel protetor das respostas específicas de células T ao HIV-1 no controle da replicação viral e na preservação de enfermidades associadas ao HIV-1. Mc Michael e outros, 200; Miueles e outros, 2002; Pantaleo e Harari, 2006; Pantaleo e Koup, 2004; Rosemberg e outros, 1997, 2000) Certos perfis funcionais das respostas de células TCD4 e TCD8 específicas ao HIV-1 têm sido apresentadas com correlação ao mais efetivo controle de replicação viral e enfermidade estável (Appay e outros, 2004c, 2005, 2006; Betts e outros,2006; Harari e outros, 2004c, 2005,2006; Iyasere e outros, 2003; Lichterfeld e outros, 2004; Migueles e outros, 2002; Panteleo e Harari, 2006; Pantaleo e Koup, 2004; Rosember e outros, 1997; Younes e outros, 2003; Zimmerli e outros, 2005). Cm respeito às células TCD4, respostas vigorosas de células T proliferativas CD4 específicas contra o HIV-1 estão correlacionadas a mais baixos níveis de carga viral e ais efetivo controle de replicação viral seguindo a infecção primária (Rosemberg e outros, 1997). Além disso, também tem sido demonstrado que um componente crítico das respostas protetoras de células TCD4 específicas para o HIV-1 são representadas pela presença de IL-2 secretada de células TCD4 (veja descrição adiante). Vigorosas respostas de células TCD4 conta o HIV-1 também são constantemente encontradas em LTNPs (pessoas que não progridem por longo tempo). (Harari e outros, 2004c, 2005; Iyasere e outros, 2003; Tilton e outros, 2007).

As evidências de um papel protetor das respostas específicas de células T contra o HIv-1 são ainda mais fortes para células TCD8 (Betts e outros, 1999; Pantaleo e Harari, 2006; Pantaleo e Koup, 2004). Em particular, existem várias observações defendendo o papel protetor das respostas de células TCD8 específicas para o HIV-1:
1) Vigorosas respostas de células TCD8 específicas contra o HIV-1 compostas de células citotóxicas, proliferativas e secretoras de IL-2 (veja descrição adiante) são achadas em LTNPs (Zimmerli e outros, 2005);
2) Respostas específicas de células TCD8 contra o HiV-1 são encontradas em sujeitos respectivamente expostos ao HIV-1 que permanecem não infectados (Kaul e outros, 2004; Makedonas e outros, 2005);
3) A associação temporal entre o aparecimento de respostas específicas de células TCD8 contra HIV-1 e a supressão da carga viral durante a infecção primária (Mc Michael e outros, 2000);
4) A rápida progressão da doença segundo a emergência da doença seguida à emrgência de vírus mutantes escapa à resposta de células TCD8 (Mc Michael e outros, 2000); e
5) A depleção de células TCD8 em macacos infectados com o vírus de imunodeficiência símio está associada com perda do controle da replicação viral e altos níveis de carga viral (Schmitz e outros, 2005).

RESPOSTAS IMUNES ESPECÍFICAS PARA O HIV-1
ALEXANDRE HARARI E GIUSEPPE PANTALEO

CAPÍTULO DO LIVRO HIV-1: MOLECULAR BIOLOGY E PATHOGENESIS
Tradução: Isabela Matheus
Continuação



B. CINÉTICA DAS RESPOSTAS ESPECÍFICAS DE CÉLULAS T CONTRA O HIV NA INFECÇÃO PRIMÁRIA


As respostas vigorosas de células T específicas contra o HIV-1 e particularmente das células TCD8 são associadas com a infecção primária (Gandhi e Walker, 2002). Nesse sentido, tem sido mostrado que células TCD8 específicas para o HIV-1 podem ser massivamente expandidas e representadas acima de 40% do total de células TCD8. Como mencionado anteriormente, o pico de respostas de células TCD8 está correlacionado com o declínio de altos níveis de viremia, e este é certamente um importante papel na supressão inicial da replicação viral (Pantaleo outros, 1994). A resposta da população massiva de células TCD8 específicas para o vírus expandidas durante a infecção primária é principalmente direcionada a um epítopo singular (Cao e outros, 2003). A população de células TCD8 específicas para o HIV-1 expandida inicialmente reduz progressivamente conforme os níveis de viremia declinam. Por isso, está claro que essa resposta de células TCD8 inicial é muito poderosa, e é aceitável que essa resposta exerça alta pressão seletiva como indicado pela diversificação da seqüência viral e eventualmente a emergência de vírus mutantes que escapam. Após a transição para a fase crônica da infecção, a magnitude da resposta de células TCD8 específicas contra o HIV-1 é geralmente mais baixa comparada à infecção primária. Entretanto, mudanças substanciais ocorrem na especificidade e tolerância da resposta das células TCD8 específicas para o HIV-1 (Asso e outros, 2003; Cao e outros, 2003). As respostas de células TCD8 específicas para o HIV-1 são direcionadas contra diferentes proteínas do HIV-1 e contra múltiplos epítopos. Dessa forma, existe uma especificidade mais ampla e uma tolerância mais larga da resposta das células TCD8 específicas para o HIV-1 durante a infecção crônica (Altfeld e outros, 2001). A emergência do escape de vírus mutantes ocorre menos freqüentemente durante a infecção crônica assim indicando a presença de limitada pressão seletiva ao vírus mediada pela resposta de células TCD8 específicas contra o HIV-1. Adicionalmente, essas observações estão no sentido de uma resposta de células TCD8 menos eficiente. A esse respeito, um estudo recente mostrou um rearranjo (deslocamento) proveniente da alta atividade para a baixa atividade das células TCD8 específicas para o HIV-1 da primeira fase para a fase crônica da infecção consistente com uma menor eficiência da resposta de células TCD8 durante a infecção crônica (Lichterfeld e outros, 2007).

A cinética da resposta de células TCD4 específica para o HIV-1 é certamente muito influenciada pela depleção massiva inicial de células TCD4 associada com a infecção primária. (Bunchley e outros; Mattapallil e outros, 2005). Como mencionado anteriormente, a presença de células TCD4 proliferativas específicas para o HIV-1 está associada com melhor controle da infecção primária (Rosemberg e outros, 2000). Adicionalmente, essas células TCD4 também secretam IFN-y (interferon gama) (veja descrição adiante) (Pitcher e outros, 1999). Com respeito à especificidade da resposta, esta é predominantemente direcionada contra GAG enquanto esta (proteína) tenha sido apresentada, já que as respostas de células TCD4 ao envelope rapidamente desaparecem.

C. PERFIL FENOTÍPICO E FUNCIONAL DAS RESPOSTAS DE CÉLULAS TCD4 E TCD8 ESPECÍFICAS PARA O HIV-1.

A caracterização das respostas de células T específicas para o HIV-1 têm sido o objeto de grande número de estudos e nenhum tipo de anormalidade fenotípica e funcional tem sido descrita (Apay e outros, 2002; Autran e outros, 1995; Brenchley e outros, 2003; Champagne e outros, 2001; Gillespie e outros, 2000; Hanann e outros, 1997; Harari e outros, 2004ª, 2006; van Barle e outros, 2002; van Lier e outros, 2003; Weecks e outros, 1999a,b; Zimmerli e outros, 2005). Por estas razões é importante promover algum conhecimento geral dos marcadores fenotípicos e funções que são geralmente usados para definir populações de antígenos (Ag)-específicos de células T em diferentes estágios de diferenciação antes de entrar em detalhes sobre as anormalidades observadas na infecção por HIV.

D.FENÓTIPO


O termo “células T de memória” é geralmente usado para definir células T experientes em antígenos que estão presentes após o retraimento da resposta imune que é associada com a eliminação do antígeno ou efetiva remoção. (Sprent e Surh, 2002; Zimkernagel e outros, 1996). Ambas condições refletem tanto a eliminação do patógeno ou o controle efetivo mediado pelo sistema imune. Por isso, cautela deve ser usada na utilização do termo “células T de memória” na infecção por HIV onde o patógeno não é eliminado nem efetivamente controlado. Por estas razões, nós pensamos que o termo antígeno-específico e não células T de memória é mais apropriado para discutir o perfil fenotípico de células T específicas para o HIV-1.
Os marcadores que tem sido extensivamente usado para definir células TCD4 e TCD8 antígeno-específicas incluem CD45RO, CD45RA, CD62L, CD28, CD27, CD7, CD57, CD127 E CCR7 (Appay e outros, 2002; Autran e outros, 1995; Brenchley e outros, 2003; Champagne e outros, 2001; Gillespie e outros, 2000; Hamann e outros, 1997; Harari de outros, 2004ª, 2006; van Baarle e outros, 2002; van Lier e outros, 2003; Weeks e outros, 1999 a, b; Zimmerli e outros, 2005). O uso desses marcadores tem sido instrumental para identificar células T antígeno-específicas em diferentes estágios de diferenciação. Como mostrado na figura 1, quatro níveis de diferenciação de células T (inicial, intermediário, avançado e terminal) têm sido definidos e a regra geral é que os marcadores de células listados acima são progressivamente perdidos durante a diferenciação. (Kaech e outros, 2002; Klenerman e Hill, 2005. Van Lier e outros, 2003). Células TCD4 e TCD8 no primeiro estágio de diferenciação expressam CD45RA/RO, CD28, CD27, CD7, CD127 e CCR7 e CD27; no estágio intermediário CD45RO, CCR7 e CD27; no estágio avançado CD45RO; e no último estágio adquirem CD45RA e CD57 (Harari e outros, 2006; Kaech e outros, 2002; Klenerman e Hill, 2005; van Lier e outros, 2003). O marcador CD57 tem sido associado com células T senescentes (velhas) (Brenchley e outros, 2003).

O uso combinado de CCR7 e CD45RA tem sido a primeira combinação de marcadores levando à identificação de duas populações distintas fenotipicamente e funcionalmente de células T antígeno-específicas (Sallusto e outros, 2004,1999). A distinção foi predominantemente baseada sobre a expressão de CCR7. Populações de células TCD4 e TCD8 expressando CCR7 são chamadas memória central (TCM) e células T sem CCR7 são chamadas efetoras de memória (TEM) (Sallusto e outros, 2004, 1999). Isto é importante para sublinhar que TCM reside predominantemente em órgãos linfóides secundários e estão no primeiro estágio de diferenciação comparada com TEM que é concentrada na periferia e no local de infecção. CD27 tem sido usada em combinação com CD45RA/RO para definir populações de TCM e TEM (van Baarle e outros, 2002; van Lier e outros, 2003). Entretanto, CD27 e CCR7 não identificaram populações similares de TCM e TEM e, por isso, cautela tem que ser usada na comparação de resultados de estudos usando esses dois marcadores.(Harari e outros, 2006).

CD127, a IL-7Rα, é um marcador valioso e tem sido apresentada como expressada em células TCD4 e TCD8 de longa vida (Kaech e outros, 203).
O uso combinado de CD45RA/RO, CCR7 e CD127 define quatro populações distintas de células TCD4 e TCD8 antígeno-específicas:

1) TCM definidas por CD45RA-/RO + CD127 + CCR7 + fenótipo;
2) TEM definidas por CD45RA-/RO + CD127-/+ CCR7 – fenótipo;
3) Efetor terminal (TET) definidas por CD45RA+/RO- CD127 – CCR7 – fenótipo;
4) Efetoras (E) definidas por CD45RA-/RO+ CD127 – CCR7 – fenótipo.

O fenótipo das células TCD4 específicas para o HIV-1 durante a infecção primária é típico de células efetoras e assim CD45RA – CCR7 – CD127 -(Harari e outros, 2004ª, 2005, 2006). Esse perfil fenotípico não é diferente daquele observado para células TCD4 específicas para CMV (citomegalovírus) durante a infecção primária por CMV (Harari e outros, 2004ª, 2005, 2006) Por isso, o fenótipo de células TCD4 específicas para o HIV-1 não tem nenhuma anormalidade e é consistente com um típico efetor primário de resposta de células T durante o primeiro encontro com o patógeno.
Entretanto, na infecção crônica, o fenótipo de células TCD4 específicas para o HIV-1 é substancialmente diferente daquele observado para células TCD4 específicas para vírus contra CMV, EBV e HSV que embora estabeleçam infecções crônicas são efetivamente controlados pela resposta imune (Appay e outros, 2002; Klenerman e Hill, 2005; van Lier e outros, 2003) O fenótipo das células TCD4 específicas para o HIV-1 permanece inalterado na infecção crônica comparado à infecção primária. (Harari e outros, 2004a, 2006). Dessa forma, existe um típico fenótipo de células efetoras, e isso é consistente com ambas a falta de eliminação e de controle do HIV-1 na infecção crônica. O controle mais efetivo da replicação viral no caso da infecção crônica por HIV-1 em LTPNs (portadores não progressores a longo prazo) e de inecção por HSV é refletida por células TCD4 específicas ao vírus com ambos fenótipos TCM e TEM (Harari e outros, 2004ª, 2006). Em defesa de um controle mais efetivo da replicação viral durante a infecção crônica, o fenótipo de células TCD4 específicas para CMV e EBV é consistente com aquele de células TCD4 TCM, TEM e TET. (Harari e outros, 2004a, 2006).
Considerações similares podem ser feitas para o perfil fenotípico de células TCD8 específicas para o HIV durante as infecções primária e crônica. O fenótipo de células TCD8 específicas para CMV e HIV-1 durante a infecção primária é típico de células efetoras e assim CD45RA – CCR7 – CD127 - e assim consistente com a resposta primária típica de células T. Como para células TCD4, o fenótipo de células TCD8 específicas para HIV-1 permanecem inalteradas na infecção crônica comparadas com a infecção primária consistentemente com a persistência do HIV-1 e com a falta de controle da replicação viral (Zimmerli e outros, 2005). Entretanto, células TCD8 específicas para o HIV-1 de LTNPs e células TCD8 específicas para influenza têm perfis fenotípicos característicos de TCM e TEM. Finalmente, o fenótipo de células TCD8 específicas para CMV e EBV é consistente com o de células TCD8 TCM, TEM, TET. (Harari e outros, 2006).

Por isso, existe uma boa correlação entre os perfis fenotípicos de ambas as células TCD4 e TCD8 específicas para vírus e o controle de replicação viral. Nesse sentido, é importante mencionar que um número de estudos tem demonstrado uma correlação entre a magnitude da população de células TCD8 específicas para HIV-1 e controle viral, que é, baixo nível de viremia em sujeitos com infecção crônica (Champagne e outros, 201; Ellefsen e outros, 2002).

RESPOSTAS IMUNES ESPECÍFICAS PARA O HIV-1
ALEXANDRE HARARI E GIUSEPPE PANTALEO

CAPÍTULO DO LIVRO HIV-1: MOLECULAR BIOLOGY E PATHOGENESIS
Tradução: Isabela Matheus
Continuação

E. FUNÇÃO

Durante os últimos anos, uma série de funções Têm sido apresentadas como relevantes na imunidade antiviral (Appay e outros, 2000; Belts e outros, 2003, 2004; Harari e outros, 2004ª, 2005, 2006; Tyasere e outros, 2003; Lichterfeld e outros, 2004; Mallard e outros, 2004; Pantaleo e Harari, 2006; Pantaleo de Koup, 2004; Seder e Ahmed, 2003; Simi e outros, 2005; Younes e outros, 2003; Zimmerli e outros, 2005. Eles incluem:
1) Capacidade proliferativa;
2) Secreção de citocinas/quimiocinas incluindo IL-2, IFN-gama, TNF-alfa, e MIP-1beta; e
3) Cititoxidade como é meddo pela expressão de perforina/ granzima β e atividade de imobilização/degranulação de CD107 a/b.

Em base de análises de IL-2 e IFN-ƴ (gama), três populações funcionalmente distintas de células TCD4 antígeno-específicas (IL-2 singulares, IL-2/IFN- ƴ duais e IFN- ƴ singulares) tem sido identificadas (Betts e outros, 2006; Harari eoutros, 2004c, 2005, 2006; Pantaleo e Harari, 2006; Youner e outros, 2003; Zimmerli e outros, 2005). Além disso, a presença de células T secretoras de IL-2 é consistentemente associada com a capacidade proliferativa de células antígeno-específicas. (Harari eoutros, 2004c, 2006; Zimmerli e outros, 2005) Populações de célullas TCD4 antígeno-específicas IL-2 singulares e demais IL-2/IFN-gama têm capacidade proliferativa intrínseca enquanto as células singulares IFN-y têm pobre capacidade proliferativa que pode ser promovida na presença de IL-2 exógena. (Harari eoutros, 2004c, 2006; Zimmerli e outros, 2005). Uma grande porcentagem (maior que 60%) de células TCD4 antígeno-específicas secretam TNF-alfa e, baseado na secreção de IFN-gama, duas populações equitativamente representadas de células singulares de IFN-gama e duais de IFN-gama/ TNF-alfa (fator de necrose tumoral–alfa) são identificadas.
Com respeito a células TCD8, duas populações de células TCD8 antígeno-específicas (duais IL-2/IFN-gama e singular IFN-gama) podem ser definidas baseadas na habilidade de secretar IL-2 e IFN-gama (Zimmerli e outros, 2005). Ambas populações de células TCD8 são citotóxicas como foi medido pela expressão de perforina e granzima B ou pela atividade degranulatória seguindo a estimulação antígeno-específica (Harari e outros, 2006). Entretanto, a expressão desses marcadores de funções citotóxicas é maior (mais notável) em células TCD8 singulares de IFN-gama comparadas às duais IL-2/IFN-gama. As células TCD8 duais IL-2/IFN-gama proliferam seguindo a estimulação antígeno-específica através de um mecanismo autócrino (denotando auto-estimulação através da produção celular de um fator e de um receptor específico para este. Dic.Stedman). Células TCD8 singulares de IFN-gama não tem capacidade proliferativa intrínseca, e sua proliferação pode ser resgatada na presença de células TCd4 antigeno-específicas e de IL-2 exógena. (Harari e outros, 2006; Pantaleo e Harari, 2006; Zimmerli e outros, 2005). Além disso, a totalidade virtual de células secretoras de TNF-alfa eram também células secretoras de IFN-gama, que são duais IFN-gama/ TNF-alfa. Finalmente o acesso do MIP-1β tem sido proposto por definir percentual variável (de mais de 30%) de células TCD8 antígeno-específicas não produtoras de IL-2, TNF-alfa e IFN-gama (Betts e outros, 2006).
Recentemente, o termo multifucional tem sido usado para definir respostas de células TCD4 e TCD8 que, em adição a funções típicas de efetoras tal como a secreção de IFN-gama, TNF-alfa, MIP-1β, e atividade citotóxica, compreendem distintas populações de células T também hábeis para secretar IL-2 , retendo a capacidade de proliferação antígeno- específica. O termo “somente efetora” define respostas de células T ou populações de células T hábeis para secretar citocinas tais como IFN-gama, TNF-alfa e MIP-1β,e dotadas de atividade citotóxica, mas faltando IL-2 e capacidade proliferativa.
Os padrões de resposta de células TCD4 específicas para o HIV-1 durante a infecção primária são típicos de respostas “somente efetora”, que é, células TCD4 secretoras de TN-alfa e IFN-gama com falta de capacidade proliferativa. Esse padrão não é diferente daquele observado nas respostas primária de células TCD4 específicas para CMV. Os padrões de resposta de células TCD4 específicas para o HIV-1 durante a infecção crônica são dependentes do grau de controle de replicação do vírus. Na ausência de controle de replicação viral, as respostas de células TCD4 específicas para o HIV-1 permanecem inalteradas se comparadas com a infecção primária e mantêm um perfil de efetoras. Na presença de controle efetivo de replicação viral seguindo a terapia antiviral ou em LTNPs, o perfil de resposta de células TCD4 específicas para o HIV-1 torna-se multifuncional (Harari e outros, 2005, 2006; Tiltron e outros, 2007). A supressão da replicação do vírus é por isso associada com a presença de populações de células TCD4 específicas para o HIV-1 secretoras de IL-2 somente e de IL-2/IFN-gama dotadas de capacidade proliferativa (Harari e outros, 2005,2006; Tilton e outros, 2007). Essas observações defendem fortemente a hipótese de que a replicação do vírus e altos níveis de carga viral impedem a geração de células TCD4 específicas para o HIV-1 secretoras de IL-2 e proliferativas. (Harari e outros, 2005, 2006; Tilton e outros, 2007). O desenvolvimento de um modelo multifuncional de respostas de células TCD4 específicas para o HIV-1 somente sob condições e efetiva supressão de replicação viral também é consistente com os padrões de resposta de células TCD4 específicas para o vírus observadas em uma série de infecções virais crônicas tais como CMV, EBV, HSV e HCV (Harari e outros, 2005, 2006; Tilton e outros, 2007). Em todos os exemplos desses modelos de infecção viral crônica, a presença de respostas de células TCD4 multifuncionais está associada com controle de replicação viral mais efetivo (Harari e outros, 2005, 2006; Tilton e outros, 2007). Similares às respostas de células TCD4, os padrões de respostas de células TCD8 específicas para o HIV-1 durante a infecção primária são típicos de uma resposta “somente efetora”, que é, IFN-gama e TNF-alfa secretadas de células TCD8 e não diferente daquela observada nas respostas primárias de células TCD8 específicas para CMV.
Similares às respostas de células TCD4, os padrões de respostas de células TCD8 específicas para o HIV-1 durante a infecção primária são típicos de uma resposta “somente efetora”, que é, IFN-gama e TBF-alfa secretadas de células TCD8 e não diferente daquela observada nas respostas primárias de células TCD8 específicas para CMV. Os padrões de resposta de células TCD8 específicas para o HIV-1 durante a fase crônica de infecção por HIV-1 foram somente em parte relacionadas por extensão da carga viral (Pantaleo e Harari, 200). Assim como para a resposta de células TCD4, os padrões de resposta das células TCD8 específicas para o HIV-1 permanecem típicos de resposta efetora na ausência de controle de replicação viral e alta carga viral (Zimmerli e outros, 2005). Entretanto, o desenvolvimento de respostas de células TCD8 específicas para o HIV-1 multifuncionais ocorre somente em 30% a 40% de sujeitos que são tratados com sucesso com terapia antiviral (Pantaleo e Harari, 2006). Por isso, respostas de células TCD8 específicas para o HIV-1 multifuncionais não são readquiridas em uma grande porcentagem de sujeitos a despeito da supressão da replicação viral e de carga viral (Zimmerli e outros, 2005). Esses achados são diferentes daqueles obtidos em respostas de células TCD4 específicas para o HIV-1 que são consistentemente associadas com a recuperação das respostas multifuncionais após a supressão da replicação viral mediada por terapia. Respostas multifuncionais de células TCD8 específicas para o HIV-1 são, entretanto, consistentemente encontradas em LTNPs (Betts e outros, 2006; Zimmerli e outros, 2005). Além disso, as respostas multifuncionais de células TCD8 vírus-específicas também são encontradas em infecções virais tais como influenza, CMV, EBV nas quais o vírus é ou completamente eliminado ou eficientemente controlado após o estabelecimento da infecção crônica (Harari e outros, 2006; Pantaleo e Harari, 2006).
Essas observações tomadas juntas indicam que, como para células TCD4, as repostas multifuncionais das células TCD8 também são consistentemente associadas com controle mais efetivo da replicação viral. Entretanto, em adição à carga viral, outros fatores parecem influenciar o desenvolvimento de respostas multifuncionais de células TCD8.

F. ESPECIFICIDADE E AMPLITUDE DE RESPOSTAS DE CÉLULAS T ESPECÍFICAS PARA O HIV-1

Caracterizações extensivas de especificidade e de amplitude de respostas de células T específicas para o HIV-1 têm sido desempenhadas particularmente para células TCD8. Células TCD8 específicas para o HIV-1 reconhecem um grande número de epítopos dentro de diferentes proteínas do HIV-1 incluindo estruturais, regulatórias, e proteínas assessórias. A este respeito, um estudo recente tem apresentado uma associação entre a presença de respostas de células TCD8 específicas para Gag em baixos níveis de viremia. (Kiepiela e outros, 2007). Em contraste, respostas de células TCD8 contra o Env e proteínas regulatórias são associadas com níveis mais altos de viremia (Kiepieka e outroa, 2007). Essas observações são de interesse e indicam a possibilidade de que respostas imunes marcando certas regiões do HIV-1 podem ser mais protetoras do que outras e eventualmente influenciam o curso clínico de infecção crônica do HIV-1. Entretanto, não está claro se as respostas de células TCD8 específicas para Gag são diretamente responsáveis por maior controle de replicação viral ou se as repostas de células TCD8 específicas para Env são realmente pouco efetivas. Não pode ser excluído que o surgimento de respostas específicas para Env é relativamente o resultado e não a causa da alta na replicação viral. Em defesa desse estudo prévio, tem sido mostrado também que ao final das respostas de células TCD8 específicas para Gag, uma grande amplitude de respostas de células TCD8 está associada a maior controle da replicação viral.

Capítulo “HIV-1 INTEGRASE INHIBITORS: UPDATE AND PERSPECTIVES” ; autores: Elena A. Semenova, Christophe Marchand, e Yves Pommier; do livro: HIV-1 MOLECULAR BIOLOGY AND PATHOGENESIS, CLINICAL APPLICATIONS, DE KUAN-TEH JEANG

INIBIDORES DE INTEGRASE: ATUALIZAÇÃO E PERSPECTIVAS

I-VISÃO GERAL DO CAPÍTULO

A replicação do HIV requer a inserção do genoma viral dentro do genoma nuclear de células infectadas através de um processo de recombinação catalisado pela enzima codificada pelo vírus, Integrase (IN). A Integrase do HIV tem sido recentemente reconhecida como um objetivo anti-viral atingível, seguindo os resultados promissores de inibidores de Integrase em testes clínicos. Este capítulo foca os avanços recentes no entendimento dos mecanismos celulares de integração do HIV e os sítios de atuação de inbidores. Ele também proporciona uma lista extensiva das mutações conhecidas que têm caracterizado a Integrase do HIV-1 com seu impacto na atividade da enzima IN, replicação viral, e resposta a drogas anti-IN. Novas abordagens razoáveis para inibição da integração do HIV também são discutidas, assim como os dois inibidores de Integrase em testes clínicos e outros inibidores selecionados em desenvolimento.

II - PRÓLOGO

Os resultados encorajadores informados e o conhecimento recente sobre os co-fatores de integração do DNA têm renovado o interesse na farmacologia da Integrase do HIV e na biologia celular. O capítulo corrente oferece uma visão geral das funções dos co-fatores de Integrase para a integração. Ele foca as abordagens farmacológicas para interferir com a integração e proporciona uma extensiva lista de mutações da IN com seus impactos farmacológicos e funcionais. Referências têm sido mantidas para o mínimo. Informações adicionais podem ser encontradas em revisões recentes (Dayan et al,2006; Marchand et al, 2006ª; Pommier et al, 2005; Savarino, 2006. Semenova et al, 2006b; Zhao et al, 2007).

III- Integração: uma etapa crucial no ciclo de vida do HIV.

Semelhante a outras retroviroses, o genoma do HIV consiste em fitas singulares de RNA. Durante a infecção, o RNA é liberado na célula hospedeira sugerindo a fusão de partículas virais com a membrana celular. O RNA viral então serve como um padrão para a síntese de uma fita dupla de DNA copiada do RNA viral (cDNA) produzindo longos terminais de repetição (LTRs) pela transcriptase reversa (RT) codificada do HIV. A conversão do RNA viral em cDNA é necessária para a produção de novas cópias de RNA e para a transcrição de genes codificadores virais. A transcrição do cDNA viral também requer sua inserção em um cromossomo hospedeiro. Essa inserção (integração) é catalisada pela enzima codificada do HIV IN (Integrase). O cDNA viral integrado no cromossomo hospedeiro é chamado pró-vírus. Dependendo do sítio de integração, o pró-vírus pode ser constitutivamente transcrito se ele é integrado perto de um promotor ativo, ou permanecer silencioso até a resposta por pressão de disparadores de transcrição. A transcrição do genoma viral e dos genes virais seguida de tradução, empacotamento , fusão e maturação fornecem os componentes moleculares para a liberação de novas partículas virais infecciosas.

A)A ESTRUTURA DA INTEGRASE DO HIV-1.

As três enzimas virais (protease, transcriptase reversa e integrase) são codificadas dentro do gene POL do HIV e traduzidas em uma poli-proteína. A Integrase (32kDa) é liberada da poli-proteína pela protease do HIV durante a maturação. A proteína IN consiste de três domínios: N-terminal (extremidade da cadeia peptídica que termina em NH2, nas ligações entre aminoácidos, amídicas, um NH2 do carbono alfa de um aminoácido liga-se ao COOH unido ao carbono alfa do outro aminoácido;obs. da trad.), cerne (ou catalítico) e domínio C-terminal (extremidade que termina em COOH, sendo assim, a seqüencia de aminoácidos cresce da ponta livre em NH2 para a ponta livre em COOH.;obs. da trad.). O domínio N-terminal intensifica a multimerização através da coordenação de zinco (motivo HHCC) e promove a integração combinada e duas extremidades de cDNA virais juntas dentro do cromossomo da célula hospedeira. O domínio C-terminal é responsável pela ligação de DNA independente de seqüência e independente de metal. Cada molécula de integrase do HIV-1 contém um sítio catalítico dentro do domínio do cerne carregando três aminoácidos essenciais: Asp64, Asp 116 e Glu152 (motivo D,D-35-E). Estes resíduos ácidos coordenam ao todo um, e provavelmente, dois cátions divalentes (Mg2+ ou Mn2+) que formam uma ponte com os substratos de DNA. A mutação de algum destes resíduos extingue a atividade enzimática da IN e a replicação viral. A IN funciona como um multímero.

B)QUÍMICA DE INTEGRAÇÃO RETROVIRAL

Durante a primeira reação catalisada pela IN [3’-processado (3’-P)], o DNA doador (viral) é hidrolisado imediatamente no lado 3’ a partir do dinucleotídeo conservado CA (dinucleotídeo são dois nucleotídeos ligados no sentido de fita, não no sentido de pares de base, quando formam pontes de hidrogênio com a combinação C-G, ou A-T; obs. da trad.) em ambos finais 3’ (de cada fita do DNA viral duplo) das duas seqüências de repetição nas extremidades (LTRs). 3’-P liberam os nucleotídeos terminais de 3’ (geralmente os dinucleotídeos GT para o HIV-1) e geram finais 3’-hidroxila (-OH) nucleofílicos (nucleofílica é a reação que envolve um nucleófilo; nucleófilo é o átomo doador de um par de elétrons numa reação química, em que o par de elétrons é capturado por um eletrófilo; qualquer reagente ou substância atraída para uma região de baixa densidade eletrônica. Dic. Stedman) em ambas extremidades do DNA viral. O próximo passo, a integração [transferência de fita(ST)] procede no núcleo através de uma reação de transesterificação (?), onde os finais 3’-OH nucleofílicos processados do cDNA doador (viral) são inseridos na espinha dorsal do alvo de DNA hospedeiro. Ambos finais (extremidades) inserem-se com cinco pares de bases hesitantes através do sulco maior do DNA (a hélice de DNA não forma sulcos regulares entre os giros; obs. da trad.) cromossômico tarjado, seguindo o acompanhamento das junções de fenda e ligação do cDNA do HIV integrado pelo mecanismo de reparo de DNA da célula hospedeira (Alguma enzima DNA ligase deve fixar as extremidades coesivas dos LTRs virais com o sítio de inserção; obs da trad.)

C) A INTEGRAÇÃO OCORRE DENTRO DE UM GRANDE COMPLEXO MACROMOLECULAR

A integração celular requer vários co-fatores em adição à IN. O complexo de pré-integração (PIC) é uma unidade estrutural crucial para a integração. O PIC contém proteínas de ambos o cerne viral (matriz, nucleocapsídeo, transcriptase reversa) e da célula hospedeira [LEDGEF/p75, o fator derivado das lentes epiteliais), um interador de integrase 1 (INI1), o fator de barreira de auto-integração (BAF), a proteína A1 de alta mobilidade de grupo cromossômico (HMGA1)]. O cDNA viral é provavelmente ligado à IN seguindo imediatamente a transcrição reversa. A IN também liga-se diretamente ao LEDGEF/p75, INI1, transcriptase reversa e matriz.
Não obstante muitas informações descrevendo a importância dos co-fatores de integração do HIV, nosso entendimento dos mecanismos de regulação da integração permanecem incompletos. Em nossa opinião, a principal função do PIC é separar as duas reações catalisadas pela Integrase (3’-P e ST) em diferentes compartimentos celulares durante o momento “in vivo”, enquanto “in vitro” essas duas reações ocorram conseqüentemente sem atraso (sem adiamento). É plausível que a IN possa ser mantida inativa no PIC antes da migração para o núcleo para prevenir a auto-integração. Um co-fator celular presente no PICm a BAF, impede a auto-integração. Outros fatores associados ao PIC provavelmente tembém mantém a IN inativa. Por hora, a transcriptase reverda do HIV pode inibir as atividades catalíticas da IN “in vitro”. O cDNA viral é protegido da digestão por nucleases ap´s o isolamento do PIC somente com a IN de tipo selvagem (não mutada; obs. da trad.), enquanto torna-se sensível à digestão por nucleases quando o PIC é formado por integrases mutantes. Assim, a IN é provavelmente envolvida não somente no 3’-P bem cedo no cico viral, mas também na formação do PIC. A formação do PIC pode ser disparada quando ocorre o processamento completo da reação 3’-P pela integrase. Também é aceitável que o rearranjo do PIC, levando à reativação da IN, ocorra durante a passagem do PIC através do envelope nuclear (a membrana nuclear ) e/ ou durante sua associação com a cromatina.
Nós focaremos dois fatores que são conhecidos por fixar o cDNA viral ao DNA cromossômico do hospedeiro, a emerin e a LEDGEF/p75. Recentemente, a interação do cDNA viral com a cromatina tem sido anunciado como dependente de emerin, uma proteína nuclear associada ao PIC através da proteína BAF. Ambas emerim e BAF são requeridas para a localização apropriada do cDNA viral no núcleo antes da integração. Entretanto, a emerin e a BAF não facilitam a integração do HIV. Outra molécula de fixação da IN do HIV à cromatina é a LEDGEF/p75. Ligações de LEDGEF/p75 à IN direcionam a IN para a cromatina e promovem a transferência de fita. A falha da replicação do HIV em células nocauteadas para LEDGEF/p75 sugere que a LEDGEF/p75 é um co-fator crítico para a integração eficiente do HIV. A ruptura dessas interações com a IN poderá ser considerada como uma estratégia terapêutica.

IV- ABORDAGENS PARA INIBIR A INTEGRAÇÃO DO HIV.

A)Pequenas Moléculas Inibidoras das Atividades Enzimáticas da Integrase do HIV.

Procurando por inibidores enzimáticos da IN é fácil de compreender. Ensaios altamente produtivos têm sido desenvolvidos, e muitos ensaios “in vitro” são rotineiramente usados para elucidar os mecanismos de ação das drogas (Marchand e outros, 2001). Ensaios de 3’-P monitoram a liberação do dinucleotídeo terminal (GT) a partir de um oligonucleotídeo duplo (de fita dupla) que imita o final do longo terminal de repetição (LTR) viral enquanto a transferência de fita resulta numa grande molécula de DNA. Substratos clivados previamente (final 3’ processado pela IN) são usados para determinar a inibição de transferência de fita independentemente de 3’-P. A desintegração (desagregação), a terceira reação catalizada pela IN [ao contrário da reação de ST, (Chow e outros,1992)], pode ser usada para avaliar o sítio de atuação das drogas, como esta é a única reação que pode ser catalizada pelo cerne da IN. Compostos que competem com alvos de DNA dentro do sítio catalítico da enzima produzem inibição preferencial da Transferência de Fita sobre o 3’-P e são geralmente inefetivos contra a desintegração (Espeseth e outros , 2000). Estes inibidores são comumente referidos como “inibidores de transferência de fita” (STI). Em contraste, inibidores que previnem a ligação do DNA viral à integrase inibem ambos o 3’-P e a ST com eficiência similar (Bonnenfant e outros, 2004; Marchand e outros, 2006b).
Como permanece difícil obter drogas de integrase em estrutura de cristal (com formatos regulares entre as moléculas), os ensaios sobre a ligação da IN e o DNA continuam por ser desenvolvidos para investigação de sítios de ligação para drogas no complexo IN-DNA. Os ensaios de base Schiff (Mazumder e Pommier, 1995) e a ligação atravessada dissulfídica (Johnson e outros, 2006) podem ser usados para determinar se uma dada droga afeta a ligação do DNA à IN ou se altera o contato crucial da transferência de fita entre o resíduo de aminoácido Q148 da IN e a citosina no final proeminente do DNA viral (Johnson e outros, 2007). Um novo inibidor de sítio de ligação da IN do HIV foi descoberto no dispositivo dimérico do cerne da IN, usando-se análises de marcadores de foto-afinidade e espectrometria de massa [espectrometria é um procedimento para observar e medir os componentes de onda de luz ou outras emissões eletromagnéticas. Dic.Stedman] (Al-Marvsawi e outros, 2006).
O desenvolvimento de inibidores têm focado o alvejamento do motivo D,D-35-E e o quelado de metal divalente (Mg2+ versus Mn2+) ligado na interface do complexo IN-DNA (Semenova e outros, 2006b). Nós temos nos referido a esse modo de inibição como “inibição interacial” (Pommier e Cherfils, 2005; Pommier e outros, 2005; Pommier e Marchand, 2005) porque a droga liga-se na interface de duas macromoléculas (aqui a IN e o DNA), um intermediário catalítico (aqui a etapa 3’-P), dessa forma prevenindo a atividade catalítica produtiva (aqui a transferência de fita, ST). A inibição interfacial é comumente observada por amplo raio de ação de produtos naturais alvejando uma variedade de alvos celulares (Pommier e Cherfils, 2005). Uma atenção foi dada ao motivo D,D-35-E depois de 5CITEP [um ácido diqueto (DKA) derivativo similar] ter sido primeiro co-cristalizado no domínio catalítico da IN do HIV e demonstrado ligar-se com o motivo D,D-35-E (Goldgin e outros, 1999). Inibidores de IN correntemente em testes clínicos também contém os motivos semelhantes a DKA que são creditados por quelarem cátions divalentes (Mg2+ ou Mn2+) dentro do motivo D,D-35-E. Estas drogas demonstraram inibição preferencial à reação de transferência de fita. Inibidores de transferência de fita (STI) preferenciais foram primeiro observados por CAPE (éster fenetílico ácido cafeico) e julgado por estar relacionado à quelação dos metais divalentes da IN (Fesen e outros, 1993). Esse modelo foi melhor desenvolvido para os derivativos de DKA, os quais eram apresentados por atuar como competidores para o DNA alvo do cromossomo do hospedeiro no sítio de atividade da IN (Hazuda e outros, 2000). Os benefícios dos inibidores de transferência de fita emergiram com a caracterização de componentes mais potentes de DKA efetivos contra a infecção por HIV (tabelas II e III). Os resíduos de IN envolvidos na resistência a DKA e semelhantes a DKA estão listados na tabela I.
Como o 3’-P é um pré-requisito para a transferência de fita e a integração do HIV, e é provavelmente requerido para a formação do PIC, a inibição da reação 3’-P é uma abordagem racional para inibir a replicação do HIV. Também é lógico combinar inibidores de 3’-P com os inibidores de ST correntemente desenvolvidos.
Um derivativo de stirilquinolina (SQL), FZ-41, inibe ambos 3’-P e ST com similar eficiência (Bonnenfant e outros, 2004), e tem sido confirmado como um inibidor de Integrase do HIV celular pelo desenvolvimento de viroses resistentes a drogas. A atividade anti-viral de FZ-41 pode servir como um paradigma para inibidores de ‘-P que também podem prevenir a formação do PIC. A inibição de importação nuclear de Integrase após o tratamento com SQL pode ser uma conseqüência da falha na formação do PIC. (Mousnier e outros , 2004).

B.A marcação do PIC

De acordo com o paradigma de uma inibição interfacial (Pommier e Cherfils, 2005; Pommier e Marchand, 2005), as interações proteína-proteína (monômero de IN- monômero de IN, IN-LEDGEF/p75, IN-matrix, IN-INI!, matrix, BAF, etc.) e funções da proteína com DNA (IN-DNAviral, BAF-DNA viral, etc) dentro do PIC são igualmente importantes para a integração. Alterações em qualquer dessas interfaces podem evitar a integração. Por exemplo, inibidores do tipo DKA altera o alvo de superfície de ligação do DNA dentro do sítio de atividade da IN (interface de proteína e DNA) devido à quelação de cátions divalentes após a etapa 3’-P. Outro candidato alvo é LEDGEF/p75, pois a replicação do HIV é marcadamente reduzida em células sem LEDGEF/p75 devido à abstenção da interação IN-LEDGEF/p75 (Vandekerckhove e outros, 2006). Por isso, prevenção ou alteração de contatos de macromoléculas entre componentes do PIC é uma abordagem racional e promitente para a inibição da integração do HIV. Resíduos de IN específicos interagindo com os componentes do PIC são culminados na Tabela I. Ensaios desenvolvidos para identificar inibidores de funções enzimáticas da IN (contato proteína-DNA) podem não identificar inibidores interfaciais pois os contatos interfaciais com os componentes do PIC não são requeridos para as atividades enzimáticas de IN “in vitro”. (Emiliani e outros, 2005). Tais compostos poderiam ser por isso erroneamente excluídos durante a rotina de verificação bioquímica, embora eles ainda possam alterar a formação do PIC “in vivo”, o que ressalta a necessidade de desenvolverem-se ensaios adicionais para inibidores de integrase.

V- INIBIDORES EM TESTES CLÍNICOS

O primeiro inibidor farmacológico em teste clínico foi um quarteto de guanosina (AR-177, Zintevir, Aronese Pharmacêutico, Inc.) Não obstante ter sido identificado inicialmente como u inibidor de IN baseado em atividades “in vitro” (Mazumder e outros, 1996ª), este composto também foi descoberto por inibir a entrada do vírus “in vivo”. AR-177 foi descontinuado após a fase I/II de teste clínico. Os dois inibidores de IN seguintes em teste clínico (Savarino, 2006; Semenova e outros 2006b) foram um derivativo de naftiridina (naphtyl é naftaleno) carboxamida (-CONH2) (L-870,810) (Merk & Co.) (Hazuda e outros, 2004; Little e outros, 2005) e um derivativo de DKA (S-1360/GW-810781) (Shionogi-Glaxo Smith Kline Pharmaceuticals) (Glaxo Smith Kline, 2003; Yoshinaga e outros, 2002; Tabela II). Ambos foram descontinuados após a fase II de testes. L-870,810 causava toxidade em cães durante dosagem de longa duração. As razões para o término dos testes clínicos de S-1360 não tem sido fartamente reveladas (Glaxo Smith Kline, 2003). Entretanto, suas propriedaades bem toleradas em humanos (tabela II) demonstram a prova do conceito para uso de inibidores de integrase do HIV-1 como anti-retrovirais.
Dois inibidores de IN estão correntemente em testes clínicos: um derivativo de antibióticos quilononas (uma classe de agentes antibacterianos sintéticos que inibem a ação das bactérias. Dic.Stedman) (JTK-303/GS-9137, Gilead Sciences, INC) (DeJesus e outros, 2006; Kawaguchi e outros, 2006; Matsuzaki e outros, 2006; Sato e outros, 2006) e um STI da “Merck & Co.” (MK-0518) (Laufer e outros, 2006; Markowitz e outros, 2006; Morales-Ramirez e outros;2005; Summa e outros, 2006; tabela III). Sua eficácia e boa tolerância em pacientes tratados excessivamente que tiveram falha na inibição da transcriptase reversa e inibidores de protease (tabela II) é encorajadora, especialmente para pacientes vivendo com múltipla resistência a drogas contra o HIV.

VI- INIBIDORES EM DESENVOLVIMENTO PRÉ-CLÍNICO

Revisões tem sido envolvidas em detalhes com o desenvolvimento e progresso no esboço de inibidores de integrase (Dayam e outros, 2006; Johnson e outros, 2004; Pommier e outros, 2005; Savarino, 2006; Semenova e outros,2006b; Zhao e outros, 207). Por isso, nenhuma tentativa é feita aqui para listar tais inibidores. Nós somente sumarizaremos e revisaremos classes selecionadas de inibidores de Integrase do HIV em potencial de liderança da droga (tabela III). A Tabela I também lista todos os resídus de IN envolvidos em mecanismos de resistência a drogas.
Testes de extratos naturais ativos biológicamente (plantas, micróbios, fungos, organismos marinhos) continuam a servir como um conjunto para identificação de novas lideranças. A maioria dos inibidores de IN relatados são derivados de produtos naturais. Os exemplos incluem CAPE (Fesen e outros, 1993), antraciclinas (agente anti-câncer que inclui três moléculas: uma aglicona pigmentada, um amino-açúcar e uma cadeia lateral.dic.Stedman) (Fesen e outros, 1993), curcumina (pigmento amarelo das raízes e vagens da Curcuma Longa, usado em doenças do fígado e biliares; encontrada no caril em pó; inbe a 5-hipoxigenase. Sin tumeric yellow. Dic.Stedman) (Mazumder e outros, 1995, 1997), flavonas (potente inibidor da biossíntese das prostaglandinas) e flavonóides (substâncias de origem vegetal que contém flavona em diversas combinações (antoxantinas, apigeminas, flavona, quercitinas, etc. dic.Stedman)(Fesen e outros, 1994; Rowley e outros, 2002), ligninas e lignóides (Eich e outros, 1996; Ovenden e outros, 2004), depsídeo e depsidonas (Neamati e outros, 1997ª), alfa-hidroxtropolonas (Semenova e outros, 2006a), ácido lithospermico (Abd-Elazen e outros, 2002), indolicidina (Krajewski e outros, 2003 2004; Marchand e outros, 2006b) ácido chicórico (Meadows e outros, 2005; Neamati e outros, 1997b), integrasona (Herath e outros, 2004), e cumarínicos (Mazumder e outros 1996ª; Zhao e outros, 1997)[cumarinas, termo descritivo em geral de anti-coagulantes e outras substâncias dervadas do dicumarol, um componente da fava-de-cheiro (cumaru). Dic.Stedman]. A despeito do fato de que muits destes componentes inibam outros alvos virais como a transcriptase reversa, a protase e a glicoproteína 120 (Mazunder e outros, 1996b; Pluyner e outros, 2000; Pommier e Neamati, 1999, Roberson e outros, 1998; Semenova e outros, 2006ª), seu relacionamento de atividade estrutural demonstrou a importância dos grupos hidroxi para a atividade anti-integrase assim como sugeriu seu possível mecanismo de ação como queladores de metal (Fesen e outros, 1994). Uma abordagem interessante consiste do estudo paralelo do relacionamento da atividade estrutural com alvos de HIV rigorosamente relataos tal como IN e RHase H (Semenova e outros, 2006ª). Um novo produto natural identificado como inibidor de IN é funalenona (Shiomi e outros, 205), isolado do Penicillium SP. FKI-1463 (tabela III), apresenta boa atividade antiviral.
Ao todo três estratégias são correntemente usadas para a descoberta de inibidores de IN sintéticos:
1)Derivativos químicos baseados em previamente conhecidos inibidores de IN com DKA (Barreca e outros, 2005; Di Santo e outros, 2005), naftiridina (Embrey e outros, 2005; Guare e outros, 2006), SQL (Normand-Bayle e outros, 2005), L-CA (Charvet e outros, 2006), e alfa-hidroxitropolonas (Budihas e outros, 2005; Didierjean e outros, 2005; Semenova e outros, 2006a);
2)buscas farmacofóricas tridimensionais baseadas em componentes previamente descobertos (Deng e outros, 2006);
3) moléculas híbridas compreendendo estruturas do cerne de dois ou mais inibidores conhecidos [DKA-catequina /DKA-catecol (maurin e outros, 2006), DKA-nucleobase scaffold híbrido (Nair e outros, 2006)]
Ao mesmo tempo, componentes bifuncionais (que contém dois grupos ativos idênticos) proporcionam uma racionalidade para o trabalho suplementar devido às potentes propriedades inibidoras de um derivativo de DKA bifuncional (CPD8, tabela III; Di Santo e outros, 2005) e de dissulfonas geminadas análogas ao ácido chicórico (componente 4), tabela III (Meadows e outros , 2005).
Como a IN funciona como um multímero, a dimerização de inibidores (Camarasa e outros, 2006) deve ser considerada. Entretanto, a limitação é desenvolver ensaios que possam promover evidências sem ambigüidades de cada mecanismo. Na mesma linha, é lógico considerar drogas que se ligam na interface da macromolécula do complexo formado pela IN e co-fatores celulares durante a integração. A inibição da interface da IN-LEDGEF poderia requerer o desenvolvimento de ensaios que monitoram as interações proteína-proteína não somente através da redução de sua formação, mas também pela estabilização/captura de intermediários abortivos, como no caso de inibidores inter-faciais (Pommier e Cherfils, 2005; Pommier e Marchand, 2005).

VII-PERSPECTIVAS

O principal gol da terapia anti-HIV é a eficiência da supressão da carga viral por mais tempo possível, isto é, sem a emergência de viroses resistentes. Para alcançar tal gol, é racional a combinação de terapias direcionando vários alvos virais. Alvos específicos do vírus são sempre atrativos porque inibidores seletivos podem ser privados de efeitos colaterais como a falta de alvos específicos do vírus em células infectadas.
Após a descoberta inicial da IN em 1978 (Grandgenett e outros, 1978) e o estabelecimento de sua requisição para a replicação do HIV (Hippenmeyer e Grandgenett, 1984), descobertas importantes tem pavimentado o caminho para o desenvolvimento de inibidores da IN. Estes incluem ensaios “in vitro” para integração (Bushman e Craigie, 1991; Craigie e outros, 1990, 1991; Fitzgerald e outros, 1991; Katzman e outros, 1989; Sherman e Fyfe, 1990); a identificação de domínios e resíduos altamente conservados (Engeman e Craigie, 1992; vanGent e outros, 1993; Vink e Plasterk, 1993; Vink e outros, 1993; tabela I); a determinação de estruturas de cristal no cerne do domínio C por raio X (Bujacz e outros, 1995; Chen e outros, 2000; Dyda e outros, 1994) elucidação da solução da estrutura do domínio N (Cai e outros, 1997); e o papel de co-fatores celulares na integração do HIV (Cherepanov e outros 2005).
Resultados promissores de testes clínicos para inibidores de IN (De Jesus e outros, 2006; Markowitz e outros, 2006 e Savarino, 200) apresentam a apreensibilidade para o uso de inibidores de IN como terapia anti-retroviral. Essa tremenda realização iniciará o desenvolvimento de novos inibidores baseados nos existentes e em novos tipos químicos. A obtenção estruturas co-cristais para os mais efetivos e promissores inibidores é limitada pelo desafio da solução de estruturas de grande extensão ligadas à IN ligada por seus substratos ao DNA (DNAs duplos do doador viral e do aceptor alvo). Entretanto, não está excluído que os inibidores por si mesmos deverão ajudar a elucidar essas estruturas se eles podem atuar como inibidores de interface e captores de complexos macromoleculares estáveis. Junto ao mapeamento de mutações na IN de resistência a drogas, essas estruturas deverão proporcionar uma razão para modificações químicas adicionais e melhoramento de inibidores. A busca por inibidores de IN clinicamente efetivos inclui a otimização dos parâmetros farmacológicos tal como uma reduzida ligação a proteínas do soro humano e dependência limitada de rotas de ativação metabólica (Laufer e outros, 2006). Finalmente, depois de terapias sistêmicas, inibidores de IN tópicos estão prosseguindo com vantagem como terapias curativas e preventivas.

(Capítulo “HIV-1 INTEGRASE INHIBITORS: UPDATE AND PERSPECTIVES” ; autores: Elena A. Semenova, Christophe Marchand, e Yves Pommier; do livro: HIV-1 MOLECULAR BIOLOGY AND PATHOGENESIS, CLINICAL APPLICATIONS, DE KUAN-TEH JEANG.)

Trecho do OMIM sobre a antitripsina alfa 1, que é um inibidor de protease que se liga às proteases: elastase, tripsina, quimotripsina (um inibidor da protease digestiva), trombina e proteases bacterianas.Tradução: Isabela Matheus

107400 PROTEASE INHIBITOR 1; PI
Alternative titles; symbols
PI1ALPHA-1-ANTITRYPSIN; AATANTI-ELASTASEANTITRYPSINSERPINA1ALPHA-1-ANTITRYPSIN DEFICIENCY, AUTOSOMAL RECESSIVE, INCLUDED
Gene map locus 14q32.1
TEXT

DESCRIPTION

Alpha-1-antitrypsin is a protease inhibitor, deficiency of which is associated with emphysema and liver disease. The protein is encoded by a gene (PI) located on the distal long arm of chromosome 14.

A antitripsina alfa 1 é um inibidor de protease cuja deficiência está associada com a enfisema e doenças do fígado. A proteína é codificada por um gene (PI) localizado distantemente no braço longo do cromossomo 14.

CLINICAL FEATURES

Deficiency of protease inhibitor activity is associated with several of the electrophoretic variants of serum alpha-1-antitrypsin; Axelsson and Laurell (1965) first suggested that the genes for electrophoretic variants are allelic with the deficiency gene. Laurell and Eriksson (1963) described absence of alpha-1-antitrypsin from the plasma in patients with degenerative lung disease leading to death in middle life. (Eriksson (1989) gave an interesting historical account including the pedigree of his first family (Eriksson, 1965).) Emphysematous changes involve primarily the lower lung fields (Bell, 1970).

A deficiência da atividade do inibidor de protease está associada a várias das variantes eletroforéticas da antiripsina alfa 1 no soro; Axelsson e Laurell (1965) sugeriram primeiro que os genes das variantes eletroforéticas são alélicos à deficiência do gene (são alelos que tornam o gene deficiente). Laurell e Erilsson (1963) descreveram a ausência de antitripsina alfa 1 do plasma de pacientes com doença degenerativa dos pulmões , levando à morte na metade da vida. (Eriksson (1989) ofereceu uma avaliação histórica interessante incluindo a linhagem de sua primeira família (Eriksson, 1965).) Alterações enfisematosas envolvem primariamente os campos mais baixos dos pulmões (Bell,1970).

Many electrophoretic variants of serum alpha-1-antitrypsin have been described, beginning with those reported by Axelsson and Laurell (1965). Some of these variants are associated with reduced protease activity and occasionally with clinical consequences. Kueppers and Bearn (1967) studied an Italian family with multiple members heterozygous for an electrophoretic variant that could not be distinguished from that which Axelsson and Laurell (1965) found in a Swedish family. The polymorphism of prealbumin described by Fagerhol and Braend (1965) was shown by Fagerhol and Laurell (1967) to be the same as the alpha-1-antitrypsin polymorphism. Fagerhol (1968) suggested that the system be called Pi for protease inhibitor.

Muitas variants eletroforéticas da antitripsina alfa 1 so soro tem sido descritas, iniciando com aquelas retratadas por Axelsson e Laurell (1965). Algumas dessas variantes são associadas com atividade de protease reduzida e ocasionalmente com conseqüências clínicas. Kuppers e Bearn (1967) estudaram uma família italiana com múltiplos membros heterozigotos fará uma variante eletroforética que não podia ser distinguida daquelas que Axelsson e Laurell (1965) acharam numa famíla sueca. O polimorfismo da pré-albumina descrito por Fagerhol e Braend (1965) foi demonstrado por Fagerhol e Braend (1965) como o mesmo polimorfismo da antitripsina alfa 1. Fagerhol (1968) sugeriu que o sistema fosse chamado Pi por ser inibidor de protease.

Gans et al. (1969) described familial infantile liver cirrhosis in presumed homozygotes for alpha-1-antitrypsin deficiency. Udall et al. (1982) speculated that a factor in the pathogenesis of infantile cirrhosis may be lack of protease inhibitor to counteract the effects of proteases that cross the intestinal barrier in the neonate. Lake-Bakaar and Dooley (1982) found that alpha-1-antitrypsin is an important proteolytic inhibitor in bile, thus providing support of the pathogenetic theory of Udall et al. (1982). Aagenaes et al. (1972) described the clinical picture in children with the ZZ genotype as neonatal cholestasis. Five such cases were described.

Gans e outros (1969) descreveram uma cirrose do fígado infantil de famíla em presumidos homozigtos para deficiência de antitripsina alfa 1. Udall e outros (1982) especularam que um fator na patogênese da cirrose infantil pode ser a falta do inibidor de protease para conter o efeito de proteases que atravessam a barreira intestinal dos neonatos. Lake-Bakaar e Dooley (1982) descobriram que a antitripsina alfa 1 é um importante inibidor proteolítico na bile, assim proporcionando fundamentos à teoria petogênica de Udall e outros (1982). Aagenaes e outros (1972) descreveram o retrato clínico numa criança com o genótpo ZZ como colestase (interrupção do fluxo da bile.dic Stedman) neonatal. Cinco casos foram descritos.

Morin et al. (1975) concluded that heterozygotes are not at increased risk of alcoholic cirrhosis. Eriksson et al. (1986) concluded that the risk of cirrhosis and liver cancer is increased for males homozygous for alpha-1-antitrypsin deficiency but not for females. The finding suggested additive effects of exogenous factors. Geddes et al. (1977) found that the frequency of non-M phenotypes was increased to a significant extent in patients with sclerosing alveolitis with or without rheumatoid arthritis. Fargion et al. (1981) found an increased frequency of non-M phenotypes in patients with hepatocellular carcinoma. Furthermore, patients with liver cancer and a non-M phenotype had a lower average age than those with an M phenotype.

Morin e outros (1975) concluiram que heterozigotos não estão em risco aumentado para cirrose alcoólica. Eriksonn e outros (1986) concluíram que o risco da cirrose e do câncer no fígado é aumentada para homens homozigotos para deficiência em antitripsina alfa 1, mas não para mulheres. O achado sugeriu efeitos adicionais de fatores exógenos. Geddes e outros (1977) acharam que a freqüência de fenótipos não-M foi aumentada para uma significativa extensão em pacientes com alveolite esclerosante com ou sem artrite reumatóide. Fargion e outros (1981) acharam uma freqüência aumentada de fenótipos não-M em pacientes com carcinoma hepatocelular. Além disso, pacientes com câncer no fígado e um fenótipo não-M tiveram uma média de idade mais baixa do que aqueles com o fenótipo M.

Phenotypic correlations indicate that there are 3 types of mutations: those producing deficiency of PI, null mutations, and mutations causing altered function of the gene product. PI Z and PI M(Malton) are deficiency mutations that are associated with both emphysema and liver disease. PI S, M(Heerlen), M(Mineral Springs), M(Procida), M(Nichinan), I, and P(Lowell) are deficiency mutations with an increased risk of emphysema only. The null mutations are associated with emphysema only. PI Pittsburgh is an example of a mutation leading to altered function of the gene product with a bleeding disorder as the clinical presentation. Crystal (1990) gave a comprehensive review of the pathogenetic relationship between AAT deficiency and emphysema and liver disease, including a detailed listing of the various mutations that have been identified and a discussion of the possibilities for therapy.

Correlações fenotípicas indicaram que existem três tipos de mutações: aquelas produzindo deficiência de PI, mutações nulas e mutações causando funções alteradas do produto do gene. PI Z e PI M (Malton) são mutações de deficiência que são associadas com ambas enfisema e doença do fígado. PI S, M(heerlen), M (Mineral Springs), M(Procida), M(Nichian), I, e P (Lowell) são mutações de deficiência com um risco aumentado só para enfisema. As mutações nulas são associadas somente com enfisema. PI Pittsburgh é um exemplo de uma mutação levendo à função alterada do produto do gene com uma desordem de sangramento assim como de apresentação clínica. Crystal (1990) apresentou uma revisão compreensiva do relacionamento patogênico entre a deficiência AAT e a enfisema de doença do fígado, incluindo uma listagem detalhada das várias mutações que têm sido identificadas e uma discussão sobre as possibilidades para terapia.

An adult with antitrypsin deficiency and combined liver and lung disease was reported by Gherardi (1971). See the study of 12 cases of combined disease by Berg and Eriksson (1972). Contrary to the usual view that liver disease, while a risk in children, is not a great risk to adults with alpha-1-antitrypsin deficiency, Cox and Smyth (1983) found a relatively high risk in men between 51 and 60 years. A low concentration of serum prealbumin was a sensitive indicator of impaired liver function.

Um adulto com deficiência de antitripsina e doença combinada do fígado e dos pulmões foi revelado por Gherardi (1971). Contrariamente à visão usual de que a doença do fígado, enquanto um risco para crianças, não é um grande risco para adultos com deficiência de antitripsina alfa 1, Cox e Smyth (1983) acharam um risco relativamente alto em homens entre os 51 e 60 anos. Uma baixa concentração sérica de pré-albumina foi o indicador sensitivo da reduzida função do fígado.

Wiebicke et al. (1996) confirmed the absence of pulmonary function abnormalities in the vast majority of children with homozygous alpha-1-PI deficiency. Rodriguez-Cintron et al. (1995) suggested that bronchiectasis should be considered part of the spectrum of pulmonary pathology that may be encountered in individuals with AAT deficiency. They described a 21-year-old man with massive hemoptysis and homozygous ZZ AAT deficiency. Neither panlobular emphysema nor cirrhosis of the liver was present.

Wiebicke e outros (1996) confirmaram a anormalidade da ausência da função pulmonar na vasta maioria de crianças homozgotas com deficiência de alfa-1-PI. Rodriguez-Cintron e outros (1995) sugeriram que bronquiectasia [dilatação crônica dos brônquios ou bronquíolos; broncodilatação. dic.Stedman] podia ser considerada parte do espectro de patologia pulmonar que pode ser encontrado em indivíduos com deficiência de AAT. Eles descreveram um homem de 21 anos de idade com hemoptise [emissão de sangue proveniente dos pulmões. Dic Stedman] masiva e homozigoto ZZ para a deficiência de AAT.

BIOCHEMICAL FEATURES

About 30 variants of alpha-1-antitrypsin had been described by 1981 (Hug et al., 1981). The alleles have been given symbols according to the relative electrophoretic mobility of the allele product. Cox (1978) reported the recommendations of a workshop on Pi nomenclature. Several reports (Bell and Carroll, 1973; Kuhlenschmidt et al., 1974; Eriksson and Larsson, 1975) have suggested that the defect may be in a sialyltransferase and that deficiency of antitrypsin in the blood is the result of impaired secretion from hepatocytes, increased clearance of the undersialated protein, or both. It is difficult to see how this could cause codominant inheritance or account for the different types that appear to be the products of at least 30 different alleles, unless an amino acid substitution interferes with sialidation.

Aproximadamente 30 variantes de antitripsina alfa 1 foram escritas em 1981 (Hug e outros 1981). Os alelos ganharam símbolos de acordo com a mobilidade eletroforética relativa do produto do alelo. Cox (1978) referiu recomendações de uma aula prática/oficina sobre a nomenclatura de PI. Várias reportagens (Bell e Carroll; 1973; Kuhlenschmidt e outros, 1974; Eriksson e Larsson, 1975) sugeriram que o defeito poderia ser numa sialiltransferase (transferase da saliva? OMIM números 602546, 606494 {Sialyltransferases, como ST3GAL3, catalisam a transferência do ácido siálico [da saliva] para posições terminais nos grupos carboidratos de glicoproteínas e glicolipídeos e são chaves determinantes para uma variedade de processos celulares de recognição},604402 {gangliosídeos (o mesmo que) glicoesfingolipídeo contendo ácido siálico ou gangliosídeos,têm várias funções biológicas importantes. GM3, uma membrana de glicoesfingolípídeos, participa na introdução da diferenciação, modulação e proliferação, manutenção da morfologia do fibroblasto, sinal de tradução, e adesão celular mediada pela integrina. ST3GAL5 é responsável pela síntese de GM3 (Ishii e outros, 1998), 601123, entre outros) e que esta deficiência de antitripsina no sangue é o resultado da secreção diminuída a partir de hepatócitos, aumento de remoção (espaço livre) das proteínas sob acidificação siálica (?), ou ambos. É difícil ver como isso pode causar herança co-dominante ou registro para dois dferentes tipos que parecer ser produtos de ao todo 30 alelos diferentes, a não ser que a substituição de um aminoácido interfira com a sialização.


Yoshida et al. (1976) studied a variant protein from a ZZ homozygote and showed 2 amino acid substitutions, glutamic acid to lysine and glutamic acid to glutamine. The sialic acid content of the variant protein was reduced, presumably as a result of change in configuration of the protein since none of the carbohydrate-binding amino acids were substituted.

Yoshida e outros (1976) estudaram proteínas variantes de um homozigoto ZZ e demonstraram duas substituições de aminoácidos, de ácido glutâmico para lisina e de ácido glutâmico para glutamina. O coneúdo de ácido siálico da proteína variante estava reduzido, presumivelmente como um resultado da mudança na configuração da proteína uma vez que nenhum aminoácido de ligação a carboidrato estava substituído.

The leukocytes of chronic granulomatous disease have a defect in inactivation of antitrypsin. In their experiments, George et al. (1984) found that addition of azide or catalase enhanced the effectiveness of the mutant inhibitor. AT, like other serine protease inhibitors such as antithrombin III, alpha-2-antiplasmin, and C1-inhibitor, has a single inhibitor-specific reactive site peptide bond that is formed between adjacent amino acid residues termed P(1) and P-prime(1). The reactivity of these inhibitors with proteolytic enzymes depends heavily on the nature of the residue at position P(1), the central position of the reactive center.

Os leucócitos na doença granulomatosa crônica têm um defeito na inativação da antitripsina. Em seus experimentos, George e outros (1984) acharam que a adição de azida (um composto que contém o grupamento –N3, monovalente;dic.Stedman) ou catalase intensificou a efetividade do inibidor mutante. AT, como outras serinas (ácido2-amino3- hidroxipropanóico; o L-isômero é um dos aminoácidos presenes nas proteínas; dic.Stedaman) inibidoras de protease tal como a antitrombina III, alfa-2-antiplasmina, e C1-inibidora, teve um único sítio reativo a inibidor específico de peptídio ligado que é formado entre resíduos de aminoácidos adjascentes chamados P(1) e P-prime(1). A reatividade desses inibidores com enzimas proteolíticas depende excessivamente da natureza do resíduo na posição P(1), a posição central do centro reativo.

Harrison et al. (1990) described an improved method for detecting what they termed 'low Z expressor' phenotype in MZ heterozygotes. An obligate carrier mother who was being typed as part of a family study appeared to be a PI(M)/PI(null) heterozygote. By routine isoelectric focusing, she was typed as M, her affected child as Z, and her husband as MZ. Atypically low concentrations of circulating Z peptides were demonstrated by the improved method.

Harrison e outros (1990) descreveram um método melhorado para detectar o que eles chamaram fenótipo “baixo expressor de Z” (expressante de pouco Z) nos heterozigotos MZ. Uma mãe portadora obrigatória que estava sendo caracterizada como parte de uma família em estudo pareceu ser heterozigota PI(M)/PI(null). Através da rotina de enfoque isoelétrico, ela foi caracterizada como M, seu filho afetado como Z, e seu Marido como MZ. Baixas concentrações atípicas de peptídeos Z circulantes foram demonstradas pelo método melhorado.

Weitz et al. (1992) demonstrated a correlation between plasma levels of elastase-specific fibrinopeptides and PI genotype. The levels of these peptides were highest in ZZ homozygotes and intermediate in MZ heterozygotes. This was interpreted as evidence that unopposed human neutrophil elastase (ELA2; 130130) is responsible for emphysema in patients with alpha-1-proteinase inhibitor deficiency.

Weitz e outros (1992) demonstraram uma correlação entre níveis plasmáticos de fibrinopeptídeos de genótipos específicos de elastase e PI. Os níveis desses peptídeos estavam mais altos em homozogotos ZZ e intermediários em heterozigotos MZ. Isso foi interpretado como evidência de que a elastase humana no neutrófilo não antagonizada é responsável pelo enfisema em pacientes com deficiência no inibidor da proteinase alfa1.

INHERITANCE

Family studies indicate recessive inheritance of antitrypsin deficiency. In early studies, heterozygotes, who can be detected chemically, were unaffected clinically; later studies suggested that heterozygosity may predispose to lung disease (Lieberman, 1969). For example, of 12 patients with obstructive lung disease present before age 40 years, 2 were judged by Tarkoff et al. (1968) to be homozygous for the deficiency and 1 heterozygous. Among 103 patients, Kueppers et al. (1969) found 5 homozygotes and 25 heterozygotes for the deficiency gene. They suggested that, especially in males, heterozygosity may predispose to chronic obstructive lung disease. Stevens et al. (1971) concluded that heterozygotes may develop emphysema qualitatively like that in homozygotes, but at a later age. The importance of prompt treatment of respiratory infections and avoidance of proteolytic aerosols, smoking and employment entailing exposure to respiratory irritants are important preventive measures in these families.

Estudos de família indicaram uma herança recessive de deficiência de antitripsina. Em primeiros estudos, heterozigotos, que podiam ser detectados quimicamente, não eram afetados clinicamente; estudos posteriores sugeriram que a heterosigosidade pode predispor a doenças nos plmões (Liberman, 1969). Por exemplo, de doze pacientes com doença pulmonar obstrutiva presente antes dos quarenta anos de idade, dois foram julgados por Tarkoff e outros (1968) como homozigotos para a deficiência e um heterozigoto. Entre 103 pacientes, Kueppers e outros (1969) acharam 5 homozigotos e 25 heterozigotos para a deficiência no gene. Eles sugeriram que, especialmente nos homens, a heterosogosidade pode predispor a doença crônica obstrutiva dos pulmões. Stevens e outros (1971) concluíram que heterozigotos podem desenvolver enfisema qualitativamente similar à dos homozigotos, mas em idade mais avançada. A importância do pronto tratamento de infecções respiratórias e de se evitar aerosóis proteolíticos, tabagismo e emprego vinculado à exposição à irritantes respiratórios são medidas preventivas importantes nessas famílias.

Lieberman et al. (1979) found an increased frequency of heterozygosity for antitrypsin deficiency in twins and parents of twins. They concluded that 'increased' fertility and twinning may be heterozygous advantages for antitrypsin deficiency. Clark and Martin (1982) found that the frequency of the S allele in mothers of dizygotic twins (0.088) was double that in controls (0.044). The frequency of S in the parents of monozygotic twins and in fathers of DZ twins was no higher than in controls. Normal frequencies were observed for the Z allele. No fertility indices other than twinning itself were available. To study relationships between Pi types, fertility, and twinning, Boomsma et al. (1992) studied 90 DZ and 70 MZ Dutch twin pairs and their parents. They found that mothers of dizygotic twins had frequencies of the S and Z alleles that were 3 times higher than those in a control sample. Mothers of identical twins also had a higher frequency of S than controls. The S allele may thus both increase ovulation rate and enhance the success of multiple pregnancies.

Lieberman e outros (1979) acharam uma freqüência aumentada de heterosigosidade para deficiência de anttripsina em gêmeos idênticos e parentes de gêmeos. Eles concluíram que fertilidade aumentada e de gêmeos podem ser vantagens de heterozigoto por deficiência de antitripsina. Clark e Martin (1982) acharam que a freqüência do alelo S em mães de gêmeos dizigotos [provenientes de zigotos diferentes, não são idênticos] (0.088) era o dobro do que em controles (0.044). A freqüência do alelo S em parentes de gêmeos monozigóticos e em pais de gêmeos DZ (com os alelos DZ) não era mais alta do que nos controles. Freqüências normais foram observadas para o alelo Z. Nenhum indício de fertilidade outra que não a de gêmeos de mesma natureza era avaliável. Para estudar relacionamentos entre tipos de Pi, fertilidade e geração de gêmeos, Boomsma e outros (1992) estudaram 90 pares de gêmeos DZ e 70 pares de gêmeos MZ holandeses e seus parentes. Eles descobriram que mães de gêmeos dizigóticos tinham as freqüências dos alelos S e Z três vezes mais alta do que as mães da amostra de controle. Mães de gêmeos idênticos também tinham freqüência do S mais alta do que a dos controles. O alelo S pode, assim, aumentar a taxa de ovulação e intensificar a suscetibilidade à gravidez múltipla.

MAPPING

A possible heterogeneity in recombination frequency between Pi variants believed to be allelic was reported by Gedde-Dahl et al. (1972): Pi(Z) had less recombination with Gm than Pi(non-Z). Gedde-Dahl et al. (1975) gave further data on the Gm-Pi linkage. They considered heterogeneity of recombination fraction among males of different Pi types to be likely. The major difference seemed to be between the Pi(Z) and other alleles. Possible explanations included a chromosomal deletion, inversion or locus regulating recombination in linkage disequilibrium with the Pi locus. Gedde-Dahl et al. (1981) showed that the allele-specific heterogeneity of Gm-Pi linkage is attributable to 'reduced' recombination in Z-allele heterozygotes. They found an equal sex ratio for Pi 'non-Z' variants, as opposed to a 1:2 male-female ratio for 'Z' families.

Uma possível heterogeneidade na freqüência de recombinação entre variantes de Pi acreditada por ser alélica foi reportada por Gedde-Dahl e outros (1972): Pi(Z) teve menos recombinação com Gm do que Pi (não-Z). Gedde-Dahl e outros (1975) deram dados adicionais sobre a ligação Gm-Pi. Eles consideraram a heterogeneidade das frações de recombinação entre homens de diferentes tipos de Pi para serem similares. A maior diferença pareceu ser entre o Pi(Z) e os outros alelos. Possíveis explicações incluem uma deleção cromossômica, a inversão ou recombinação regulatória do lócus em ligação desequilibrada com o lócus do Pi. Gedde-Dahl e outros (1981) demonstraram que a heterogeneidade alelo-específica da ligação Gm-Pi é atribuível a uma reduzida recombinação dos alelos Z em heterozgotos. Eles acharam uma razão igual relativa ao sexo para variantes de Pi não Z, como razão de oposição de 1 homem para 2 mulheres por família “Z”.

The location of Gm and Pi on 6p was excluded by Bender et al. (1979). By studying hybrids of mouse or rat hepatoma cells with human lymphocytes, Darlington et al. (1982) and Pearson et al. (1981) achieved direct assignment of the Pi locus to chromosome 14. From study of 2 families with abnormalities of the long arm of chromosome 14, Cox et al. (1982) localized GM to 14q32.3 and PI to a more proximal position between 14q24.3 and 14q32.1. The immunoglobulin genes are in a chromosome region noted for its high frequency of breaks associated with chromosome rearrangement, occurring both spontaneously in cultured lymphocytes and in certain malignancies.

A localização de Gm e Pi no cromossomo 6p foi excluída por Bender e outros (197). Através do estudo de células de hepatoma (carcinoma hepatocelular) híbridos de camundongo ou rato com linfócitos humanos, Darlington e outros (1982) e Pearson e outros (1981) a concluíram a marcação direta do lócus de Pi no cromossomo 14. A partir do estudo de duas famílias com anormalidades do braço long do cromossomo 14, Cox e outros (1982) localizaram GM no 14q32.3 e PI numa região proximal entre 14q24.3 e 14q32.1. Os genes da imunoglobulina estão numa região cromossômica conhecida por sua alta freqüência de quebras associada com rearranjo cromossômico, ocorrendo ambas espontaneamente em linfócitos em cultura e em certas malignidades.

By in situ hybridization, Schroeder et al. (1985) narrowed the assignment of the PI locus to 14q31-q32. Turleau et al. (1984) studied a patient with an interstitial deletion of 14q and assigned the PI locus to 14q32.1 by exclusion mapping. In a similar patient with an interstitial deletion of 14q, Yamamoto et al. (1986) confirmed the assignment to 14q32.1. By the dosage principle, the level of alpha-1-antitrypsin in the patient was only about half of that in his parents and in controls.

Através de hibridização “ in situ”, Schroeder e outros (1985) restringiram o assinalamento do lócus de Pi em 14q31-32. Turleau e outros (1984) estudaram um paciente com uma deleção intersticial de 14q e assinalaram o lóculs PI no cromossomo 14q32.1 por exclusão de mapeamento. Num paciente similar com uma deleção intersticial do 14q, Yamamoto e outros (1986) confirmaram o assinalamento no 14q32.1. Através de dosagem da origem, o nível de antitripsina alfa 1 no paciente era só aproximadamente metade daquela em seus parentes e em controles.