O TRANSPORTE NA MEMBRANA
O transporte pela membrana é o movimento de bioquímicos e outras substâncias atômicas ou moleculares através das membranas biológicas. Usualmente, dois tipos são distinguidos: o transporte ativo requer energia, enquanto o transporte passivo não.
O transporte pela membrana refere-se ao carreamento de substâncias que atravessam a membrana celular. Ele pode ser dividido em dois tipos : o transporte de proteínas atravessando a membrana
1. Contra um gradiente de concentração e requerendo energia para o transporte – o chamado transporte ativo.
2. Junto ao gradiente de concentração e não requer energia para o transporte – chamado transporte passivo.
O transporte passivo pode ser de dois tipos:
1. Difusão simples – travessia de íons e outras substâncias químicas através da membrana celular que é dependente do gradiente de concentração – as substâncias difundem-se através da membrana celular da concentração mais alta para a mais baixa.
2. Transporte facilitado – usualmente usando um carreador que se liga a uma substância e a carrega através da membrana celular sem envolver gasto de energia. Por exemplo, o transporte de ferro pela transferrina através da membrana celular.
Com base em sua especificidade para carregar substâncias, um número de transportadores tem sido identificados como o transportador cassete de ligação a ATP, o transportador de Glutamato, o transportador Neurotransmissor, o transportador de Glucose, os transportadores de dopamina entre outros. Esses transportadores podem ser agrupados em dois grupos: 1) Transportadores Cassete de ligação a ATP (Transportadores ABC) e 2) A família dos carregadores solúveis.
Os trasportadores são proteínas que podem ser situadas na superfície da membrana ou podem estar presentes no citoplasma da célula. Os últimos são ativados pela ligação de ligantes a seus receptores para alcançar a superfície da membrana para ligarem-se a substância a ser transportada. São os transportadores de Glucose.
http://bioisolutions.blogspot.com/2009/07/membrane-transport-lecture.html
terça-feira, 14 de julho de 2009
sábado, 11 de julho de 2009
Eficiente Transferência Lentiviral de Genes para as Células do Estroma Córneo usando um Laser "Femtosecond"
A-P Bemelmans, Y Arsenijevic and F Majo
Nós investigamos um novo procedimento para transferência de genes para o estroma (o arcabouço, geralmente tecido conjuntivo de um órgão) da córnea do porco para a entrega de fatores terapêuticos. Um espaço delimitado foi criado em 110 μm de profundidade com um laser LDV nas córneas do porco, e um vetor lentiviral derivado do HIV-1 expressando proteína verde fluorescente (GFP) (LV-CMV-GFP) foi injetado dentro desse espaço. As córneas foram subsequentemente dissecadas e colocadas em cultura como transplante para um meio artificial. Após 5 dias, as análises histológicas dos transplantes revelaram que o espaço da cavidade nas córneas tinha fechado e que o procedimento de transferência do gene foi eficiente sobre toda a área da cavidade. Quase todos os ceratócitos (célula fibroblástica do estroma da córnea) foram convertidos nessa área. A difusão do vetor no ângulo certo do plano da cavidade abrange de quatro camadas de ceratócitos (do lado do endotélio) a dez (do lado do epitélio). Após 21 dias, o nível de transdução foi similar aos resultados obtidos após 5 dias. A técnica de laser femtosecond permite uma injeção exeqüível e difusão de vetores lentivirais para converter eficientemente as células do estroma em áreas delimitadas. A apresentação da eficácia desse procedimento “in vitro” pode representar uma etapa importante na direção do tratamento ou da prevenção de angiogêses recorrentes do estroma córneo.
Fonte:
http://www.nature.com/gt/journal/v16/n7/abs/gt200941a.html
A-P Bemelmans, Y Arsenijevic and F Majo
Nós investigamos um novo procedimento para transferência de genes para o estroma (o arcabouço, geralmente tecido conjuntivo de um órgão) da córnea do porco para a entrega de fatores terapêuticos. Um espaço delimitado foi criado em 110 μm de profundidade com um laser LDV nas córneas do porco, e um vetor lentiviral derivado do HIV-1 expressando proteína verde fluorescente (GFP) (LV-CMV-GFP) foi injetado dentro desse espaço. As córneas foram subsequentemente dissecadas e colocadas em cultura como transplante para um meio artificial. Após 5 dias, as análises histológicas dos transplantes revelaram que o espaço da cavidade nas córneas tinha fechado e que o procedimento de transferência do gene foi eficiente sobre toda a área da cavidade. Quase todos os ceratócitos (célula fibroblástica do estroma da córnea) foram convertidos nessa área. A difusão do vetor no ângulo certo do plano da cavidade abrange de quatro camadas de ceratócitos (do lado do endotélio) a dez (do lado do epitélio). Após 21 dias, o nível de transdução foi similar aos resultados obtidos após 5 dias. A técnica de laser femtosecond permite uma injeção exeqüível e difusão de vetores lentivirais para converter eficientemente as células do estroma em áreas delimitadas. A apresentação da eficácia desse procedimento “in vitro” pode representar uma etapa importante na direção do tratamento ou da prevenção de angiogêses recorrentes do estroma córneo.
Fonte:
http://www.nature.com/gt/journal/v16/n7/abs/gt200941a.html
quarta-feira, 8 de julho de 2009
Receptores Toll-like (TLRs)
Os receptores Toll-like (TLRs) são uma classe de proteínas que atuam num papel chave no sistema imune inato. Elas são receptores não catalíticos de expansão em uma membrana singular que reconhecem moléculas estruturalmente conservadas derivadas dos micróbios. Uma vez que esses micróbios tenham ultrapassado as barreiras físicas como da mucosa do trato intestinal ou a pele, eles são reconhecidos pelos TLRs os quais ativam as respostas imunes celulares.
Eles receberam seu nome de sua similaridade com a proteína codificada pelo gene Toll identificado na Drosophila em 1985 por Christiane Nüsslein-Volhard.
Diversidade
Os TLRs são um tipo de receptor de reconhecimento padrão (PRR) e reconhecem molélulas que são geralmente compartilhadas entre os patógenos porém distintas das moléculas do hospedeiro, coletivamente referidas como padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs). Os TLRs juntos com a os receptores de Interleucina 1 formam uma super-família de receptores, conhecida como Superfamília “Receptor de Interleucina-1/Receptor Toll-Like”; todos os membros dessa família têm em comum um domínio também chamado TIR (receptor Toll-IL-1).
Três subgrupos de domínios TIR existem. Proteínas com domínio do subgrupo TIR 1 são receptores para interleucinas que são produzidos por macrófagos, monócitos e células dendríticas e todos tem domínios extracelulares de Imunoglobulinas (Ig). Proteínas com domínios do subgrupo TIR 2 são TLRs clássicas, e ligam-se diretamente ou indiretamente a moléculas de origem microbiana. Um terceiro subgrupo de proteínas contendo domínios TIR consiste de proteínas adaptadoras que são exclusivamente citosólicas e mediam a sinalização a partir das proteínas com os subgrupos 1 e 2.
Os TLRs estão presentes nos vetebrados, bem como nos invertebrados. Blocos moleculares de construção dos TLRs são representados nas bactérias e nas plantas e em outros reinos, são conhecidos por serem requeridos pela defesa do hospedeiro contra a infecção. Os TLRs assim parecem ser um dos mais antigos componentes conservados do sistema imune.
Quando os micróbios foram primeiro reconhecidos como a causa das doenças infecciosas, ficou imediatamente claro que organismos multicelulares deviam ser capazes de reconhecê-los quando infectados, e consequentemente, capazes de reconhecer moléculas únicas aos micróbios. Uma grande literatura, expandindo-se principalmente no século passado, atesta a busca por moléculas chave e seus receptores. Há mais de 100 anos atrás, Richard Pfeiffer, um estudante de Robert Koch, cunhou o termo “endotoxina” para descrever uma substância produzida pelas bactérias Gram-negativas que podia provocar a febre e o choque em experimentos com animais. Nas décadas que se seguiram, a endotoxina foi quimicamente caracterizada e identificada como um lipopolissacarídeo (LPS) produzido pela maioria das bactérias Gran-negativas. Outras moléculas (lipopeptídeos bacterianos, flagelina, e DNA não metilado) foram mostradas por sua vez por provocarem respostas do hospedeiro que são normalmente protetoras. Entretanto, essas respostas podem ser prejudiciais se elas forem excessivamente prolongadas ou intensas. Sucedeu-se logicamente que deve haver receptores para tais moléculas, capazes de alertar ao hospedeiro a presença de infecção, mas isso permaneceu elusivo (evasivo) por muitos anos.
Os receptores Toll-like são agora contado entre as moléculas chave que alertam o sistema imune para a presença de infecções microbianas. Eles são chamados assim por sua similaridade com Toll, um receptor identificado primeiro na mosca da fruta a Drosophila melanogaster, e originalmente conhecido por sua função no desenvolvimento do organismo. Em 1996, o Toll foi encontrado por Jules A.Hoffmann e seus colegas por ter um papel essencial na imunidade da mosca à infecção por fungos, o que foi alcançado pela ativação da síntese de peptídeos anti-microbianos.
O primeiro receptor Toll-like humano relatado foi descrito por Nomura e seus colegas em 1994, mapeado no cromossomo por Taguchi e seus colegas em 1996. Devido à função imune do Toll na Drosófila não ser então conhecido, assumiu-se que o TIL (agora conhecido como TLR1) deveria participar no desenvolvimento dos mamíferos. Enretanto, em 1991 (antes da descoberta do TIL) observou-se que uma molécula com um claro papel na função imune nos mamíferos, o receptor de interleucina-1 (IL-1), também tinha homologia com o Toll da Drosófila; as porções citoplasmáticas das duas moléculas eram similares.
Em 1997, Charles Janeway e Ruslan Medzhitov mostraram que o receptor Toll-like agora conhecido como TLR4 podia, quando artificialmente ligado usando-se anticorpos, induzir a ativação de certos genes necessários para a iniciação da resposta imune adaptativa. Entretanto a função dos TLRs permaneceu desconhecida no despertar desse trabalho, e em particular, nenhum ligante foi identificado para nenhum TLR dos mamíferos.
A função dos TLR foi descoberta por Bruce A. Beutler e seus colegas. Esses pesquisadores usaram clones posicionais para provar que camundongos que não podiam responder aos LPS tinham mutações que aboliam a função do TLR4. Isso identificou o TLR4 como um componente chave dos receptores de LPS, e a sugeriu fortemente que outros receptores Toll-like deveriam detectar outras moléculas assinaladoras dos micróbios, tais como as mencionadas acima.
Por outro lado, os outros genes de TLR foram selecionados nos camundongos por alvejamento de gene, fartamente no laboratório de Shizuo Akira e seus colegas. Cada TLR é considerado agora por detectar uma discreta coleção de moléculas de origem microbiana, e por sinalizar a presença de infecções.
LIGANTES
Devido à especificidade dos receptores Toll-like (e outros receptores do sistema imune inato) não pode ser facilmente alterada no curso da evolução, esses receptores reconhecem moléculas que estão constantemente associadas com ameaças (isto é, patógenos ou estresse celular) e são altamente específicos para essas ameaças (isto é, não podem ser trocados/confundidos com moléculas próprias). As moléculas associadas a patógenos que se encontram neste requisito são usualmente críticas para a função dos patógenos e não podem ser eliminadas ou trocadas através de mutações, elas são ditas por evolucionariamente conservadas. Características bem conservadas nos patógenos incluem lipopolissacarídeos (LPS) de superfície celular da bactéria , lipoproteínas, lipopepídeos e lipoarabionomanana; proteínas tais como a flagelina do flagelo da bactéria; fita dupla de RNA de viroses e ilhas CpG não metiladas de DNA viral e bacteriano; e certos outros RNA e DNA. Para a maioria dos TLRs, a especificidade de reconhecimento do ligante tem sido agora estabelecida por alvejamento do gene (também conhecido como “Knockout do gene”): uma técnica pela qual os genes podem ser individualmente apagados nos camundongos.
LIGANTES ENDÓGENOS
A resposta inflamatória estereotípica (continuada) provocada pela ativação do TLR tem provocado a especulação de que ativadores endógenos dos TLRs devem participar nas doenças auto-imunes. Os TLRs tem sido suspeitos de ligarem-se a moléculas do hospedeiro inclusive o fbrinogênio (envolvido na coagulação sanguínea) e às proteínas de choque de calor (HSPs) e ao DNA do hospedeiro.
SINALIZAÇÃO
Os TLRs são creditados por funcionarem como dímeros. Embora a maioria dos TLRs pareça funcionar como homodímeros, o TLR2 forma heterodímeros com o TLR1 ou o TLR6, cada dímero tendo uma especificidade diferente para o ligante. Os TLRs também podem depender de outros co-receptores para total sensibilidade da ligação, tais como no caso do reconhecimento dos LPS pelos TLR4, os quais requerem a molécula MD-2. A CD14 e a Proteína de ligação a LPS (LBP) são conhecidas por facilitarem a apresentação dos LPS à MD-2.
As proteínas adapatadoras e as cinases que mediam a sinalização do TLR também têm sido alvejadas. Em adição a mutagênese aleatória da linha germinativa com ENU tem sido usada para decifrar as vias de sinalização do TLR. Quando ativados, os TLRs recrutam moléculas adaptadoras para dentro do citoplasma das células de modo a propagar o sinal. Quatro moléculas adaptadoras são conhecidas por estarem envolvidas na sinalização. Essas proteínas são conhecidas como MyD88, Tirap (também chamada MAL), Trif e Tram. As adaptadoras ativam outras moléculas dentro da célula, incluindo certas proteínas cinases (IRAK1, IRAK4, TBK1 e IKKi) que amplificam o sinal, e por último levam à indução ou supressão de genes que orquestram a resposta inflamatória. Em todos, centenas de genes são ativados pela sinalização do TLR, e coletivamente, os TLRs constituem uma das principais vias de acesso para a modulação pleiotrópica (pleiotropia é a capacidade de um gene produzir produtos mutantes diversos e de vários efeitos diferentes em nível clínico e fenotípico.) dos genes já reguladas disciplinadamente.
ATIVAÇÃO E EFEITOS
Seguindo a ativação por ligantes de origem microbiana, várias reações são possíveis. As células imunes podem produzir fatores de sinalização chamados citocinas os quais disparam a inflamação. No caso do fator bacteriano, os patógenos devem ser fagocitados e digeridos, e seus antígenos apresentados às células CD4+. Em caso d fator viral, a célula infectada pode obstruir a síntese de sua proteína (viral) e submeter-se à morte celular programada (apoptose). As células imunes que detectaram um vírus também podem liberar fatores anti-virais tais como interferons.
A descoberta dos receptores Toll-like finalmente identificou os receptores da imunidade inata que eram responsáveis por muitas das funções imunes inatas que tem sido estudadas por muitos anos. Interessantemente, os TLRs parecem somente estar envolvidos na produção de citocinas e ativação celular em resposta aos micróbios, e não atuarem num papel significativo na adesão de fagocitose de microorganismos.
Toll-like receptor. (2009, May 4). In Wikipedia, The Free Encyclopedia. Retrieved 13:36, May 12, 2009, from http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Toll-like_receptor&oldid=287743888
Fonte : http://bioisolutions.blogspot.com/2009/05/toll-like-receptor.html
RECEPTORES DE RECONHECIMENTO DE PATÓGENOS
As células no sistema imune como as células dendríticas e macrófagos são a primeira linha de defesa no reconhecimento de vários tipos de patógenos. Essas células tem vários tipos de receptores desenvolvidos para reconhecer diferentes tipos de padrões moleculares associados a patógenos conhecidos como PAMPs.
Existem diferentes classes dessas proteínas, elas reconhecem diferentes tipos de PAMPs, o receptor Toll-like (TLR) é composto de múltiplas repetições ricas em leucina que são úteis para o reconhecimento de vários PAMPs. Cada membro da família TLR reconhece diferentes tipos de PAMPs. Por exemplo o TKR5 reconhece a flagelina, a qual é um constituinte altamente conservado do flagelo bacteriano. Os genomas das bactérias contém motivos de oligonucleotídeo CpG metilados que são reconhecidos pelos TLR9, uma vez que o genoma seja degradado no lisossomo.
O TLR6 e o TLR2 são dímeros que reconhecem lipopeptídeos diacil (provavelmente lipopeptídeos com duas porções acil esterificadas). O TLR1 e o TLR2 são dímeros que reconhecem lipopeptídeos triacil (o 1,2-diacilglicerol é um intermediário na síntese de triacil-gliceróis e de lecitina. Stedman) e o TLR4 reconhece lipopolissacarídeos (LPS) um componente das bactérias Gram Negativas.
Os similares TLR9, TLR3 e TLR7 estão localizados nas vesículas endocíticas e reconhecem RNA de fita dupla e de uma fita só respectivamente. Quando quaisquer TLRs são ativados, ele manda o sinal para o núcleo pela ativação de fatores de transcrição.
Alguns patógenos tais como os vírus existem e se replicam no citosol. Existem ao menos duas classes de receptores que podem detectar patógenos no citosol e sinalizar sua presença ao sistema imune. Uma classe desses receptores são os membros da família de domínio de oligomerização nuclear ou proteínas NOD.
Por exemplo a proteína NOD2, a qual é localizada no citosol, pode detectar bacterioproteoglicanos de bactérias intracelulares. Quando a proteína NOD2 reconhece seus ligantes os dipeptídeos muramil (mureínas são peptidoglicanos que cobrem as bactérias e que consistem em polissacarídeos lineares de unidades alternadas de N-acetil-D-glucosamina e ácido N-acetilmurâmico, a cujas cadeias laterais lactato estão ligados oligopeptídeos.Stedman), ela envia o sinal para o núcleo para ativar a transcrição.
Finalmente, existe uma protein receptora de classe intracelular que pode conter um domínio de helicase de RNA e dois domínios de recrutamento de caspase, um membro dessa famíla, a RIG-1, reconhece RNAs de fitas duplas que são componentes do ciclo de vida de muitas viroses.
Essa classe de proteínas também envia o sinal para o núcleo, mas diferente dos TLRs ela ativa a produção de interferons de tipo 1. Em todos esses receptores Toll Like, as proteínas NOR e as proteínas da família de domínio de helicase de RNA provêem o sistema imune inato com a capacidade de detectar ambos os patógenos extracelulares e intracelulares e de ativar as respostas imunes.
Fonte : http://bioisolutions.blogspot.com/2009/07/pathogen-recognition-receptors.html
As células no sistema imune como as células dendríticas e macrófagos são a primeira linha de defesa no reconhecimento de vários tipos de patógenos. Essas células tem vários tipos de receptores desenvolvidos para reconhecer diferentes tipos de padrões moleculares associados a patógenos conhecidos como PAMPs.
Existem diferentes classes dessas proteínas, elas reconhecem diferentes tipos de PAMPs, o receptor Toll-like (TLR) é composto de múltiplas repetições ricas em leucina que são úteis para o reconhecimento de vários PAMPs. Cada membro da família TLR reconhece diferentes tipos de PAMPs. Por exemplo o TKR5 reconhece a flagelina, a qual é um constituinte altamente conservado do flagelo bacteriano. Os genomas das bactérias contém motivos de oligonucleotídeo CpG metilados que são reconhecidos pelos TLR9, uma vez que o genoma seja degradado no lisossomo.
O TLR6 e o TLR2 são dímeros que reconhecem lipopeptídeos diacil (provavelmente lipopeptídeos com duas porções acil esterificadas). O TLR1 e o TLR2 são dímeros que reconhecem lipopeptídeos triacil (o 1,2-diacilglicerol é um intermediário na síntese de triacil-gliceróis e de lecitina. Stedman) e o TLR4 reconhece lipopolissacarídeos (LPS) um componente das bactérias Gram Negativas.
Os similares TLR9, TLR3 e TLR7 estão localizados nas vesículas endocíticas e reconhecem RNA de fita dupla e de uma fita só respectivamente. Quando quaisquer TLRs são ativados, ele manda o sinal para o núcleo pela ativação de fatores de transcrição.
Alguns patógenos tais como os vírus existem e se replicam no citosol. Existem ao menos duas classes de receptores que podem detectar patógenos no citosol e sinalizar sua presença ao sistema imune. Uma classe desses receptores são os membros da família de domínio de oligomerização nuclear ou proteínas NOD.
Por exemplo a proteína NOD2, a qual é localizada no citosol, pode detectar bacterioproteoglicanos de bactérias intracelulares. Quando a proteína NOD2 reconhece seus ligantes os dipeptídeos muramil (mureínas são peptidoglicanos que cobrem as bactérias e que consistem em polissacarídeos lineares de unidades alternadas de N-acetil-D-glucosamina e ácido N-acetilmurâmico, a cujas cadeias laterais lactato estão ligados oligopeptídeos.Stedman), ela envia o sinal para o núcleo para ativar a transcrição.
Finalmente, existe uma protein receptora de classe intracelular que pode conter um domínio de helicase de RNA e dois domínios de recrutamento de caspase, um membro dessa famíla, a RIG-1, reconhece RNAs de fitas duplas que são componentes do ciclo de vida de muitas viroses.
Essa classe de proteínas também envia o sinal para o núcleo, mas diferente dos TLRs ela ativa a produção de interferons de tipo 1. Em todos esses receptores Toll Like, as proteínas NOR e as proteínas da família de domínio de helicase de RNA provêem o sistema imune inato com a capacidade de detectar ambos os patógenos extracelulares e intracelulares e de ativar as respostas imunes.
Fonte : http://bioisolutions.blogspot.com/2009/07/pathogen-recognition-receptors.html
terça-feira, 7 de julho de 2009
A Identificação da ERGIC-53 (LMAN1) como um receptor de transporte intracellular de α1-antitripsina
Beat Nyfeler,1 Veronika Reiterer,1 Markus W. Wendeler,1 Eduard Stefan,2 Bin Zhang,3 Stephen W. Michnick,2 and Hans-Peter Hauri1
RESUMO
As proteínas secretadas são exportadas a partir do retículo endoplasmático (ER) pelo fluxo de carga e/ou transporte mediado por receptor. Nosso entendimento desse processo é limitado devido ao pequeno número de receptores de transporte identificados e as correspondentes proteínas carregadas. Nas células dos mamíferos, a proteína lectina de 53 quilo-dáltons do compartimento intermediário entre o Golgi e o ER (ERGIC-53 ou LMAN1) representa o receptor de carga melhor caracterizado. Ela ajuda na exportação de um sub-conjunto de glicoproteínas pelo Retículo Endoplasmático, incluindo os fatores de coagulação V e VIII e as catepsinas C e Z. Aqui, nós relatamos uma nova estratégia de sondagem para identificar interações de proteínas na luz da via secretória usando um ensaio de complementação de proteína baseado na proteína fluorescente amarela. Por sondagem de uma biblioteca de DNA complementar do fígado humano, nós identificamos a alfa1-antitripsina (α1-AT) como uma carga da ERGIC-53 previamente não identificada e mostramos que a captura da carga é dependente da conformação e do carbo-hidrato. As células com ERGIC-53 eliminada ou reduzida exibem um defeito específico na secreção da α1-AT que é corrigido pela reintrodução da ERGIC-53. Os resultados revelam que a ERGIC-53 é um receptor de transporte da α1-AT e proporcionam evidência direta da exportação de proteínas solúveis secretadas do ER mediada por receptor ativo nos eucariotos superiores.
INTRODUÇÃO
O lúmen (luz) do ER (Retículo Endoplasmático) proporciona um ambiente oxidativo único para o dobramento e modificação das proteínas. Uma terço de todas as proteínas recém sintetizadas são translocatadas para dentro do ER e processadas por múltiplas enimas residentes no ER. Um sistema de controle de qualidade elaborado monitora o estado conformacional das proteínas nascentes e as retém no ER durante o processo de dobramento (Ellgaard e Helenius, 2003). Quando ocorre o dobramento correto, as proteínas são exportadas do ER em vesículas de proteínas de revestimento II (COPII) (Lee e outros, 2004). Embora as proteínas transmembrana possam interagir diretamente com a malha de COPII citosólica (Barlowe, 2003), algumas proteínas solúveis do lúmen requerem receptores de carga para seu recrutamento seletivo dentro das vesículas COPII (Belden e Barlowe, 2001; Baines e Zhang, 2007). O receptor de carga melhor caracterizado é a oligomérica lectina de membrana de tipo I ERGIC-53 (Schweizer e outros, 1988). A ERGIC-53 faz ciclos entre o ER e o compartimento intermediário do Golgi e do ER (ERGIC), captura glicoproteínas solúveis no lúmen do ER, e liga-se a COPII por meio de um motivo dihidrofóbico de exportação do ER em seu caule citosólico (Hauri e outros,2000; Appenzeller-Herzog e Hauri, 2006). Como um receptor de carga, a ERGIC-53 media a exportação pelo E dos fatores de coagulação V e VIII e das catepsinas C e Z (Nichols e outros, 1998; Vollenweider e outros. 1998; Appenzeller e outros, 1999). Além disso, a ERGIC-53 foi recentemente apresentada por assistir à reunião dos polímeros da IgM no ER (Agnelli e outros, 2007).Com somente algumas proteínas carregadas pela ERGIC-53 identificadas, não se sabe, entretanto, se a exportação do ER mediada por receptor é o mecanismo de transporte predominante para o transporte de proteínas solúveis. O principal problema na identficação de complexos receptores de carga é sua natureza transitória em um ambiente iônico e oxidativo único. Além disso, as técnicas existentes em proteômica para identificação de interações proteína-proteína (ou seja, a purificação da afinidade/ espectrometria de massa ou o sistema de duas leveduras híbridas) não são facilmente aplicáveis ou não são apropriados ao estudo de proteínas de membrana. Entretanto, os ensaios de complementação de fragmento de proteína (PCAs) realmente permitem a detecção de ambas as interações transitória e dinâmica entre proteínas em células vivas intactas, incluindo aquelas para proteínas de membrana (Remy e outros, 1999; Michnick e outros, 2007). Um ensaio de complementação de fragmento de proteína (PCA) baseado em uma YFP (proteína fluorescente amarela) variante (citrina) tem-se demonstrado aplicável para interações proteína-proteína da via secretória dentro do lúmen (Nyfeler e outros, 2005). No PCAYFP, os fragmentos nos terminais N- e C- não fluoresscentes da YFP (YFP1 e YFP2) são individualmente fundidos às sequências codificadoras de duas proteínas separadas e expressados nas células mamíferas. Se as duas proteínas fundidas interagirem, os fragmentos das YFP serão trazidos à proximidade (um do outro), permitindo a dobradura e reconstituição da YFP fluorescente in vivo. Usando este ensaio específico e sensitivo, nós demosntramos que a oligomerização da ERIC-53 e suas interações com múltiplas proteínas 2 de deficiência de fator de coagulação (MCDF2) e com as catepsinas C e Z são logo visíveis nas células vivas. Aqui n´s descrevemos uma estratéia de sondagem de biblioteca de cDNA baseada em YFP PCA para identificação de novas proteínas carregadas pela ERGIC-53. A verificação de uma bilbioteca de cDNA de fígado humano adulto identificou a α1-antitripssina (α1-AT) como uma nova parceira de interação da ERGIC-53 e a validação de nossos estudos estabeleceu a ERGIC-53 como um receptor de transporte para a α1-AT.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Baseados em uma estratégia de sondagem de biblioteca de cDNA de PCA em geral (Remy e Michnick, 2004a,b), nós desevolvemos uma abordagem de verificação desenhada para identificar proteínas que se ligam a receptores de carga no lúmen do ER. A ERGIC-53 foi usada como isca e foi etiquetada no N terminal com YFP2 (yellow fluorescent protein 2= proteína fluorescente amarela 2), o que localiza a YFP2 no lado luminal da membrana e permite a verificação de interações proteína-proteína dentro do lúmen do ER. Proteínas presas foram etiquetadas com YFP1 no terminal C e expressadas a partir de uma fusão de cDNA-YFP1 de uma biblioteca. Essa orientação na fusão assegura que proteínas de membrana e secretadas codificadas pela biblioteca não sejam perturbadas. Entretanto, nós não contamos com identificar os padrões de interação já conhecidos da ERGIC-53 com essa bibioteca de cDNA-YFP1 devido às características específicas dessas proteínas ou devido à orientação específica da TFP1 presa junto ao citosol. Por exemplo, o etiquetamento das catepsinas Z e C no terminal C impede a interação com ERGIC-53 (Nyfeler e outros, 2005), enquanto a MCDF2-YFP1 é improvavelmente identificada devido a suas interações com a ERGIC-5 serem estritamente dependentes da lente total da proteína MCDF2 (Nyfler e outros 2008).
Além disso, a interação da ERGIC-53 com si mesma não pode ser detectada pois a oligomerização da ERGIC-53 requer seu domínio transmembrana (Nufer e outros,2003), o qual localiza a YFP1 de todas as proteínas YFP1-ERGIC-53 competentes na oligomerização e presas ao citosol. Esse requerimento topológico específico do compartimento é uma característic única da abordagem de PCA, proporcionando informação sobre a orientação de proteínas presas associadas à membrana. Nossa estratégia de etiquetamento do terminal C requer que as inserções à biblioteca careçam de seu códon finalizador para evitar o término da tradução antes da sequencia da YFP1. Para este fim, nós usamos cDNAs gerados por transcrição reversa de mRNA iniciada aleatóriamente, o que enriquece as extremidades 5’. Os cDNA intercalados foram sub-clonados de uma biblioteca de cDNA de fígado adulto humano dentro de vetores de expressão pcDNA3 contendo a YFP1 em todas as três sequências de leitura. A biblioteca de cDNA-YFP1 resultante continha aproximadamente 106 clones e os inseridos alternavam de 1 a 2,5 quilobases de tamanho aproximadamente. Como de se esperar para uma biblioteca gerada a partir de um tecido de secreção como o fígado, os cDNA codificadores de proteínas secretadas foram bem representados.
A sondagem da biblioteca de cDNA baseada em YFP PCA foi desempenhada em células COS-1 (de rins de macaco verde africano), as quais expressam o grande antígeno T e replicam plasmídios contendo a origem de replicação do SV40 eucariótico.
[OBS.: O virus símio 40 (SV40) e o Vírus Polioma do camundongo (PY) são viroses de tumor de pequeno DNA que têm sido extensivamente usadas para estudar a transformação celular. A primeira região do SV40 codifica três antígenos de tumor, o grande T (LT), o pequeno T (ST) e o 17KT que contribuem para a transformação celular. Enquanto o PY também codifica o LT e o ST, o médio T (MT) sozinho gera a maior parte da atividade de transformação. A transformação mediada pelo LT do SV40 requer a ligação a proteínas de supressão tumoral Rb e p53 no núcleo e a ligação do ST à proteína fosfatase PP2A no citoplasma. O LT do SV40 também se liga a várias proteínas celulares adicionais incluindo p300, CBP, Cul7, IRS1, Bub1, Nbs1 e Fbxw7 que contribuem para a transformação pelo vírus. A transformação pelo MT do PY é dpendente da ligação à PP2a e às proteínas da família das cinases de tirosina Src (PTK) e da reunião de um complexo de sinalização nas membranas da célula que leva à transforação de modo similar a Her2/neu. A fosforilação dos resíduos de tirosina da MT ativa moléculas de sinalização chaves incluindo Shc/Grb2, PI3K e PLCgama1. As contribuições únicas do LT e ST do SV40 e do MT do PY para a transformação celular tem proporcionado significativos esclarecimentos para nossa compreensão dos supressores de tumor, oncogenes e processos de oncogênese. PMID: 19505649 ]
Devido à essa característica, os plasmídios de bibliotecas de cDNA-YFP1 serão replicados na transfecção, o que assegura a expressão suficiente de proteínas roubadas (as proteínas do plasmídio) individuais e simplifica a recondução e análise de clones positivos. A co-expressão de YFP2-ERGIC-53 e da biblioteca de cDNA-YFP1 resultou na detecção de 1,63% de células COS-1 fluorescentes amarelas, e a YFP PCA pode fartamente contabilizar para o sinal detectado pois poucas células positivas foram obtidas na expressão de YFP2-ERGIC-53 ou da biblioteca de cDNA-YFP1 sozinhas. Na seleção, a YFP2-ERGIC-5 e o cDNA-YFP1da biblioteca foram transfectadas em uma razão de 10:1 para reduzir o número de plasmídios da biblioteca transfectados por célula. Isso baixou a porcentagem de células positivas para o,12% (dados não publicados). Várias centenas de células YFP positivas foram coletadas por FACS e clones presas foram reconduzidos, 48 dos quais foram individualmente reanalizados por YFP PCA em células COS-1. A co-expressão com YFP2-ERGIC-53 resultou em sinais YFP positivos para os plasmídios presas numerados com 17, 32, 33 e 44. A recondução de somente 4 positivos fora dos 48 plasmídios presa reanalidados não foi devida ao inespecificidade de nosso ensaio porém mais à captura de vários plasmídios presas por célula transfectada. Uma célula YFP positiva contém o plasmídio presa positivo tanto como muitos plasmídios negativos co-transfectados, os quais serão subsequentmente reconduzidos também.
Análises de sequência de DNA identificaram a α1-AT como o cDNA correspondente inserido nos plasmídios presa 17, 32, 33 e 44. Dois tipos de α1-AT inseridos foram encontrados, um de 1294 pares de base e uma variante de 1297 pares de base. Ambos os inseridos estava em sequencia e cobriram a sequencia codificadora completa da α1-AT com a exceção dos dois últimos aminoácidos do terminal C. A interação da ERGIC-53 com a α1-AT foi validade pelo YFP PCA nas células HeLa usando a lente total da α1-AT etiquetada no terminal N com YFP2.
A α1-AT é uma glicoproteína do fígado de 52 quilo-dáltons carregando três glicanos ligados na ponta N. Após sua síntese nos hepatócitos, a α1-AT é secretada no sangue, onde atua como uma protease inibidora de serina, principalmente contra a elastase do neutrófilo. Como uma doas maiores proteínas sintetizadas no fígado, a α1-AT é aceitavelmente altamente abundante em nossa biblioteca não normalizada. Quando a YFP-ERGIC-52 e o cDNA-YFP1 da biblioteca foram expressados nas células COS-1 após o silenciamento da α1-AT mediado por siRNA, uma redução de 30 a 50% das células YFP positivas foi observada (dados não publicados). Assim, a α1-AT parece ser responsável por mais da metade de todas as células YFP positivas em nossa verificação (Gross e outros 1982) e foi sugerido que os glicanos em N- podem servir como sítios de reconhecimento para um receptor de transporte do ER para o Golgi (Lodish e Kong, 1984). Será a ERGIC-53 um receptor de transporte para a α1-AT? Primeiro nós analisamos a especificidade do carbohidrato da interação ERGIC-53- α1-AT através da execução de um YFP PCA com a ERGIC-53 mutante em N156A e um triplo mutante de N10,107,171Q. A ERGIC-53N156A é incapaz de ligar-se aos oligossacarídeos ligados em N- nas glicoproteínas (Appenzeller e outros,1999) e a α1-ATn70,107,271Q permanece não glicosilada devido à mutagênese direcionada ao sítio dos três sítios de consenso de glicosilação do N-. Em comparação a suas equivalentes de tipo selvagem, a ERGIC-53N156A e a α1-AT N70,107,271Q mostraram uma marcada redução no sinal de YFP PCA. Esses achados sugerem que a ERGIC-53 liga-se a α1-AT de um modo dependente de carbohidrato. Nós também analisamos singularmente os mutantes N70Q, N107Q e N271Q de α1-AT e achamos que a mutagênese do segundo sítio de glicosilação em N- (N107Q) tem o efeito mais forte na interação entre a ERGIC-53 e a α1-AT [obs.: deve ser a mutação que mais prejudica a interação dessas proteínas.] Esse resultado está em total acordo com um estudo prévio mostrando que a α1-AT mutante N107Q tem um tempo de retenção intracelular significativamente mais longo do que outras mutações (Samandari e Brown, 1993). Interessantemente, todos os três sítios de glicosilação singular em N- mutantes tem taxas de degradação similares e solubilidade (Samandari e Brown, 1993). Consequentemente, o carbohidrato fixado na N107 (asparagina107) é particularmente importante para a exportação pelo ER.
Depois nós endereçamos a especificidade da conformação da interação ERGIC-53- α1-AT pela análise de duas versões da α1-AT dobradas erradamente conhecidas como as mutantes (α1-ATZ) e Hong Kong (α1-ATHK) (Stoller e Aboussouan,2005). Embora a α1-ATHK seja solúvel e degradada pela degradação associada ao ER envolvendo o proteassomo [omim 600306: proteassomas são complexos proteolíticos responsáveis pela apresentação de antígenos restritos pelo complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe I (Akiyama e outros,1994).], a α1-ATZ se agrega no ER e é submetida à deradação pelo proteossoma e pelo lisossomo (Cabral e outros, 2000; Teckman e outros, 2001).Notavelmente, em nosso YFP PCA, nem a α1-ATHK nem α1-ATZ ligaram-se à ERGIC-53. A α1-ATZ foi expressada em níveis intracelulares similares à YFP2- α1-ATWT e não foi afetada pelos dois inibidores de degradação proteassômica [omim 600306: proteassomas são complexos proteolíticos responsáveis pela apresentação de antígenos restritos pelo complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe I (Akiyama e outros,1994).] a Lactacistina (lactacystin) e a cifunensina (Kifunensine). Nós não pudemos descartar a possibilidade de que a agregação diminua o volume da ERGIC-53 solúvel ligando-se a α1-ATZ competente, dessa forma reduzindo o sinal YFP PCA. No caso da α1-ATHK, a inibição da degradação proteassômica pela lactacistina e cifunensina claramente aumentaram os níveis de YFP- α1-ATHK. Embora a quantidade de YFP2- α1-ATHK fosse desse modo restaurada àquela do manipulado de tipo selvagem, o sinal YFP PCA não foi aumentado. Esses dados sugerem que a interação ERGIC- α1-AT é dependente da conformação e sustenta uma função da ERGIC-53 de controle secundário de qualidade pela captura apenas das proteínas nativas de carga para exportação pelo ER (Ellgaard e Helenius,2003; Appenzeller-Herzog e outros, 2005).
Para confirmar que a ERGIC-53 captura a α1-AT para exportação pelo ER, nós analisamos o transporte da α1-AT endógenos em células HepG2 nas quais a ERGIC-53 foi derrubada por siRNA. O silenciamento da ERGIC-53 por 96 horas reduziu os níveis totais da proteína ERGIC-53 para menos de 20%. Intrigantemente, a derrubada da ERGIC-53 levou a uma acumulação de α1-AT em estabilidade dentro da célula. Esse efeito foi analisado além pelo estudo de transporte e secreção da α1-AT em experimentos de pulso de perseguição usando [S] metionina. A α1-AT é sintetizada como uma glicoproteína com muita manose, é submentida a complexa glicosilação no Goli, e é subsequentemente secretada no meio de cultura. Nas células HepG2 transfectadas com siRNA de controle, a α1-AT de alta manose foi rapidamente convertida nessa forma de complexo glicosilado e aproximadamente metade das proteínas foi secretada após 30 minutos de perseguição. Em contraste, nas células com a ERGIC-53 silenciadas, a α1-AT permaneceu consideravelmente mais tempo em sua forma de muita manose e somente aproximadamente 15% da proteína foi secretada após 30 minutos. A secreção ineficiente da α1-AT não é causada por um defeito geral na secreção porque a secreção da albumina endógena não foi alterada. Além disso, estudos prévios nas células HeLa tem realmente mostrado que nem a depleção nem a localização errada da ERGIC-53 mudam a morfologia da via secretora ou afetam a secreção de toda a proteína. Consequentemente, níveis reduzidos de ERGIC-53 retardam significativamente a secreção da α1-AT de maneira específica.
Para determinar se a secreção remanescente da α1-AT é causada por uma ERGIC-53, nós estudamos o transporte da α1-AT transfectada para dentro de fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) derivados de camundongos sem ERGIC-53 (-/-) e camundongos de tipo selvagem (+/+). Os experimentos de pulso de perseguição revelaram um intervalo de secreção de aproximadamente 60 minutos nas células MEFs. As células MEFs sem ERGIC-53 secretaram no mesmo tempo somente aproximadamente 25% das α1-AT recém sintetizadas e mostraram uma conversão significativamente mais lenta da forma de muita manose para complexo glicosilado da α1-AT. O defeito da secreção em geral pode ser excluído novamente por as MEFs sem ERGIC secretaram fibronectina endógena como as MEFs de tipo selvagem. Esses resultados demonstram que a secreção de α1-AT é significativamente atrasada sem a ERGIC-53 mas que uma alternativa menos eficiente na via de exportação do ER existe.
Se a ERGIC-53 é um receptor de transporte para a α1-AT, a reintrodução da ERGIC-53 certamente corrigirá a secreção defeituosa da α1-AT nas células sem ERGIC-53. De fato, quando a ERGIC-53 humana foi co-expressada com a α1-AT, a α1-AT intracelular foi consideravelmente reduzida nas células MEFs -/- num estado estável. Além disso, a ERGIC-53 aumentou a secreção da α1-AT nas MEFs -/- para o nível das MEFs +/+ após uma hora de perseguição. Consequentemente, a sobre-expressão da ERIC-53 nas MEFs sem ERGIC-53 podem restaurar a secreção de α1-AT completamente. Estudos prévios sobre a função da ERGIC-53 foram baseados principalmente em análises genéticas (Nichols e outros; 1998), estudos de transporte com uma ERGIC-53 mutante retida no ER dominante-negativa (Vollenweider e outros, 1998; Appenzeller e outros, 1999 ), ou a caracterização das interações da ERGIC-53 com as cargas (Appenzeller e outros 1999; Appenzeller-Herzog e outros, 2005; Nyfeler e outros,2005; Zhang e outros, 2005). Os estudos correntes proporcionam agora a evidência direta para uma exportação pelo ER mediada por receptor ativo de proteínas secretadas nas células dos mamíferos. Além disso, nossos dados indicam que os receptores de transporte dão ao transporte de carga mais rapidez e eficiência, mas o transporte de carga não é inteiramente bloqueado na sua ausência. A α1-AT pode possuir um Segundo receptor de transporte ou pode sair do ER por um fluxo volumoso de certa extensão. A abordagem de seleção que nós descrevemos aqui pode ser igualmente aplicada usando-se a α1-AT como uma isca para identificar novos receptores de carga. Com a α1-AT, nós agora identificamos um atrativo modelo de proteína secretada para estudar o mecanismo de exportação de proteína do ER mediado por receptor, em detalhes.
Em conclusão, esse estudo não somente identifica um receptor de transporte intracelular de α1-AT mas também abre uma avenida sem precedentes para a sondagem do genoma em sua amplitude nas interações proteína-proteína na via de secreção. A identificação profícua de uma nova proteína de carga da ERGIC-53 por sondagem de uma fusão do complexo de cDNA-YFP1 com biblioteca baseada em YFP PCA proporciona uma estratégia geral para identificar novos complexos protéicos no lúmen. Com bibliotecas normalizadas e condições ótimas de transfecção, a seleção por saturação e amplo genoma será executável no futuro próximo. Adicionalmente, a YFP PCA tem um potencial promitente para sondagen de alta produtividade de chaperones (proteínas acompanhantes) químicas e moleculares (Burrows e outros,2000) que pode resgatar defeitos de conformação (dobramento) de α1-AT mutantes e fornecer-lhes a secreção competente pela promoção de sua interação com ERGIC-53.
NOTAS
Abbreviations used in this paper: α1-AT, α1-antitrypsin; COPII, coat protein II; ERGIC, ER Golgi intermediate compartment; MCFD2, multiple coagulation factor deficiency protein 2; MEF, mouse embryonic fibroblast; PCA, protein fragment complementation assay.
FONTE:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=18283111
Beat Nyfeler,1 Veronika Reiterer,1 Markus W. Wendeler,1 Eduard Stefan,2 Bin Zhang,3 Stephen W. Michnick,2 and Hans-Peter Hauri1
RESUMO
As proteínas secretadas são exportadas a partir do retículo endoplasmático (ER) pelo fluxo de carga e/ou transporte mediado por receptor. Nosso entendimento desse processo é limitado devido ao pequeno número de receptores de transporte identificados e as correspondentes proteínas carregadas. Nas células dos mamíferos, a proteína lectina de 53 quilo-dáltons do compartimento intermediário entre o Golgi e o ER (ERGIC-53 ou LMAN1) representa o receptor de carga melhor caracterizado. Ela ajuda na exportação de um sub-conjunto de glicoproteínas pelo Retículo Endoplasmático, incluindo os fatores de coagulação V e VIII e as catepsinas C e Z. Aqui, nós relatamos uma nova estratégia de sondagem para identificar interações de proteínas na luz da via secretória usando um ensaio de complementação de proteína baseado na proteína fluorescente amarela. Por sondagem de uma biblioteca de DNA complementar do fígado humano, nós identificamos a alfa1-antitripsina (α1-AT) como uma carga da ERGIC-53 previamente não identificada e mostramos que a captura da carga é dependente da conformação e do carbo-hidrato. As células com ERGIC-53 eliminada ou reduzida exibem um defeito específico na secreção da α1-AT que é corrigido pela reintrodução da ERGIC-53. Os resultados revelam que a ERGIC-53 é um receptor de transporte da α1-AT e proporcionam evidência direta da exportação de proteínas solúveis secretadas do ER mediada por receptor ativo nos eucariotos superiores.
INTRODUÇÃO
O lúmen (luz) do ER (Retículo Endoplasmático) proporciona um ambiente oxidativo único para o dobramento e modificação das proteínas. Uma terço de todas as proteínas recém sintetizadas são translocatadas para dentro do ER e processadas por múltiplas enimas residentes no ER. Um sistema de controle de qualidade elaborado monitora o estado conformacional das proteínas nascentes e as retém no ER durante o processo de dobramento (Ellgaard e Helenius, 2003). Quando ocorre o dobramento correto, as proteínas são exportadas do ER em vesículas de proteínas de revestimento II (COPII) (Lee e outros, 2004). Embora as proteínas transmembrana possam interagir diretamente com a malha de COPII citosólica (Barlowe, 2003), algumas proteínas solúveis do lúmen requerem receptores de carga para seu recrutamento seletivo dentro das vesículas COPII (Belden e Barlowe, 2001; Baines e Zhang, 2007). O receptor de carga melhor caracterizado é a oligomérica lectina de membrana de tipo I ERGIC-53 (Schweizer e outros, 1988). A ERGIC-53 faz ciclos entre o ER e o compartimento intermediário do Golgi e do ER (ERGIC), captura glicoproteínas solúveis no lúmen do ER, e liga-se a COPII por meio de um motivo dihidrofóbico de exportação do ER em seu caule citosólico (Hauri e outros,2000; Appenzeller-Herzog e Hauri, 2006). Como um receptor de carga, a ERGIC-53 media a exportação pelo E dos fatores de coagulação V e VIII e das catepsinas C e Z (Nichols e outros, 1998; Vollenweider e outros. 1998; Appenzeller e outros, 1999). Além disso, a ERGIC-53 foi recentemente apresentada por assistir à reunião dos polímeros da IgM no ER (Agnelli e outros, 2007).Com somente algumas proteínas carregadas pela ERGIC-53 identificadas, não se sabe, entretanto, se a exportação do ER mediada por receptor é o mecanismo de transporte predominante para o transporte de proteínas solúveis. O principal problema na identficação de complexos receptores de carga é sua natureza transitória em um ambiente iônico e oxidativo único. Além disso, as técnicas existentes em proteômica para identificação de interações proteína-proteína (ou seja, a purificação da afinidade/ espectrometria de massa ou o sistema de duas leveduras híbridas) não são facilmente aplicáveis ou não são apropriados ao estudo de proteínas de membrana. Entretanto, os ensaios de complementação de fragmento de proteína (PCAs) realmente permitem a detecção de ambas as interações transitória e dinâmica entre proteínas em células vivas intactas, incluindo aquelas para proteínas de membrana (Remy e outros, 1999; Michnick e outros, 2007). Um ensaio de complementação de fragmento de proteína (PCA) baseado em uma YFP (proteína fluorescente amarela) variante (citrina) tem-se demonstrado aplicável para interações proteína-proteína da via secretória dentro do lúmen (Nyfeler e outros, 2005). No PCAYFP, os fragmentos nos terminais N- e C- não fluoresscentes da YFP (YFP1 e YFP2) são individualmente fundidos às sequências codificadoras de duas proteínas separadas e expressados nas células mamíferas. Se as duas proteínas fundidas interagirem, os fragmentos das YFP serão trazidos à proximidade (um do outro), permitindo a dobradura e reconstituição da YFP fluorescente in vivo. Usando este ensaio específico e sensitivo, nós demosntramos que a oligomerização da ERIC-53 e suas interações com múltiplas proteínas 2 de deficiência de fator de coagulação (MCDF2) e com as catepsinas C e Z são logo visíveis nas células vivas. Aqui n´s descrevemos uma estratéia de sondagem de biblioteca de cDNA baseada em YFP PCA para identificação de novas proteínas carregadas pela ERGIC-53. A verificação de uma bilbioteca de cDNA de fígado humano adulto identificou a α1-antitripssina (α1-AT) como uma nova parceira de interação da ERGIC-53 e a validação de nossos estudos estabeleceu a ERGIC-53 como um receptor de transporte para a α1-AT.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Baseados em uma estratégia de sondagem de biblioteca de cDNA de PCA em geral (Remy e Michnick, 2004a,b), nós desevolvemos uma abordagem de verificação desenhada para identificar proteínas que se ligam a receptores de carga no lúmen do ER. A ERGIC-53 foi usada como isca e foi etiquetada no N terminal com YFP2 (yellow fluorescent protein 2= proteína fluorescente amarela 2), o que localiza a YFP2 no lado luminal da membrana e permite a verificação de interações proteína-proteína dentro do lúmen do ER. Proteínas presas foram etiquetadas com YFP1 no terminal C e expressadas a partir de uma fusão de cDNA-YFP1 de uma biblioteca. Essa orientação na fusão assegura que proteínas de membrana e secretadas codificadas pela biblioteca não sejam perturbadas. Entretanto, nós não contamos com identificar os padrões de interação já conhecidos da ERGIC-53 com essa bibioteca de cDNA-YFP1 devido às características específicas dessas proteínas ou devido à orientação específica da TFP1 presa junto ao citosol. Por exemplo, o etiquetamento das catepsinas Z e C no terminal C impede a interação com ERGIC-53 (Nyfeler e outros, 2005), enquanto a MCDF2-YFP1 é improvavelmente identificada devido a suas interações com a ERGIC-5 serem estritamente dependentes da lente total da proteína MCDF2 (Nyfler e outros 2008).
Além disso, a interação da ERGIC-53 com si mesma não pode ser detectada pois a oligomerização da ERGIC-53 requer seu domínio transmembrana (Nufer e outros,2003), o qual localiza a YFP1 de todas as proteínas YFP1-ERGIC-53 competentes na oligomerização e presas ao citosol. Esse requerimento topológico específico do compartimento é uma característic única da abordagem de PCA, proporcionando informação sobre a orientação de proteínas presas associadas à membrana. Nossa estratégia de etiquetamento do terminal C requer que as inserções à biblioteca careçam de seu códon finalizador para evitar o término da tradução antes da sequencia da YFP1. Para este fim, nós usamos cDNAs gerados por transcrição reversa de mRNA iniciada aleatóriamente, o que enriquece as extremidades 5’. Os cDNA intercalados foram sub-clonados de uma biblioteca de cDNA de fígado adulto humano dentro de vetores de expressão pcDNA3 contendo a YFP1 em todas as três sequências de leitura. A biblioteca de cDNA-YFP1 resultante continha aproximadamente 106 clones e os inseridos alternavam de 1 a 2,5 quilobases de tamanho aproximadamente. Como de se esperar para uma biblioteca gerada a partir de um tecido de secreção como o fígado, os cDNA codificadores de proteínas secretadas foram bem representados.
A sondagem da biblioteca de cDNA baseada em YFP PCA foi desempenhada em células COS-1 (de rins de macaco verde africano), as quais expressam o grande antígeno T e replicam plasmídios contendo a origem de replicação do SV40 eucariótico.
[OBS.: O virus símio 40 (SV40) e o Vírus Polioma do camundongo (PY) são viroses de tumor de pequeno DNA que têm sido extensivamente usadas para estudar a transformação celular. A primeira região do SV40 codifica três antígenos de tumor, o grande T (LT), o pequeno T (ST) e o 17KT que contribuem para a transformação celular. Enquanto o PY também codifica o LT e o ST, o médio T (MT) sozinho gera a maior parte da atividade de transformação. A transformação mediada pelo LT do SV40 requer a ligação a proteínas de supressão tumoral Rb e p53 no núcleo e a ligação do ST à proteína fosfatase PP2A no citoplasma. O LT do SV40 também se liga a várias proteínas celulares adicionais incluindo p300, CBP, Cul7, IRS1, Bub1, Nbs1 e Fbxw7 que contribuem para a transformação pelo vírus. A transformação pelo MT do PY é dpendente da ligação à PP2a e às proteínas da família das cinases de tirosina Src (PTK) e da reunião de um complexo de sinalização nas membranas da célula que leva à transforação de modo similar a Her2/neu. A fosforilação dos resíduos de tirosina da MT ativa moléculas de sinalização chaves incluindo Shc/Grb2, PI3K e PLCgama1. As contribuições únicas do LT e ST do SV40 e do MT do PY para a transformação celular tem proporcionado significativos esclarecimentos para nossa compreensão dos supressores de tumor, oncogenes e processos de oncogênese. PMID: 19505649 ]
Devido à essa característica, os plasmídios de bibliotecas de cDNA-YFP1 serão replicados na transfecção, o que assegura a expressão suficiente de proteínas roubadas (as proteínas do plasmídio) individuais e simplifica a recondução e análise de clones positivos. A co-expressão de YFP2-ERGIC-53 e da biblioteca de cDNA-YFP1 resultou na detecção de 1,63% de células COS-1 fluorescentes amarelas, e a YFP PCA pode fartamente contabilizar para o sinal detectado pois poucas células positivas foram obtidas na expressão de YFP2-ERGIC-53 ou da biblioteca de cDNA-YFP1 sozinhas. Na seleção, a YFP2-ERGIC-5 e o cDNA-YFP1da biblioteca foram transfectadas em uma razão de 10:1 para reduzir o número de plasmídios da biblioteca transfectados por célula. Isso baixou a porcentagem de células positivas para o,12% (dados não publicados). Várias centenas de células YFP positivas foram coletadas por FACS e clones presas foram reconduzidos, 48 dos quais foram individualmente reanalizados por YFP PCA em células COS-1. A co-expressão com YFP2-ERGIC-53 resultou em sinais YFP positivos para os plasmídios presas numerados com 17, 32, 33 e 44. A recondução de somente 4 positivos fora dos 48 plasmídios presa reanalidados não foi devida ao inespecificidade de nosso ensaio porém mais à captura de vários plasmídios presas por célula transfectada. Uma célula YFP positiva contém o plasmídio presa positivo tanto como muitos plasmídios negativos co-transfectados, os quais serão subsequentmente reconduzidos também.
Análises de sequência de DNA identificaram a α1-AT como o cDNA correspondente inserido nos plasmídios presa 17, 32, 33 e 44. Dois tipos de α1-AT inseridos foram encontrados, um de 1294 pares de base e uma variante de 1297 pares de base. Ambos os inseridos estava em sequencia e cobriram a sequencia codificadora completa da α1-AT com a exceção dos dois últimos aminoácidos do terminal C. A interação da ERGIC-53 com a α1-AT foi validade pelo YFP PCA nas células HeLa usando a lente total da α1-AT etiquetada no terminal N com YFP2.
A α1-AT é uma glicoproteína do fígado de 52 quilo-dáltons carregando três glicanos ligados na ponta N. Após sua síntese nos hepatócitos, a α1-AT é secretada no sangue, onde atua como uma protease inibidora de serina, principalmente contra a elastase do neutrófilo. Como uma doas maiores proteínas sintetizadas no fígado, a α1-AT é aceitavelmente altamente abundante em nossa biblioteca não normalizada. Quando a YFP-ERGIC-52 e o cDNA-YFP1 da biblioteca foram expressados nas células COS-1 após o silenciamento da α1-AT mediado por siRNA, uma redução de 30 a 50% das células YFP positivas foi observada (dados não publicados). Assim, a α1-AT parece ser responsável por mais da metade de todas as células YFP positivas em nossa verificação (Gross e outros 1982) e foi sugerido que os glicanos em N- podem servir como sítios de reconhecimento para um receptor de transporte do ER para o Golgi (Lodish e Kong, 1984). Será a ERGIC-53 um receptor de transporte para a α1-AT? Primeiro nós analisamos a especificidade do carbohidrato da interação ERGIC-53- α1-AT através da execução de um YFP PCA com a ERGIC-53 mutante em N156A e um triplo mutante de N10,107,171Q. A ERGIC-53N156A é incapaz de ligar-se aos oligossacarídeos ligados em N- nas glicoproteínas (Appenzeller e outros,1999) e a α1-ATn70,107,271Q permanece não glicosilada devido à mutagênese direcionada ao sítio dos três sítios de consenso de glicosilação do N-. Em comparação a suas equivalentes de tipo selvagem, a ERGIC-53N156A e a α1-AT N70,107,271Q mostraram uma marcada redução no sinal de YFP PCA. Esses achados sugerem que a ERGIC-53 liga-se a α1-AT de um modo dependente de carbohidrato. Nós também analisamos singularmente os mutantes N70Q, N107Q e N271Q de α1-AT e achamos que a mutagênese do segundo sítio de glicosilação em N- (N107Q) tem o efeito mais forte na interação entre a ERGIC-53 e a α1-AT [obs.: deve ser a mutação que mais prejudica a interação dessas proteínas.] Esse resultado está em total acordo com um estudo prévio mostrando que a α1-AT mutante N107Q tem um tempo de retenção intracelular significativamente mais longo do que outras mutações (Samandari e Brown, 1993). Interessantemente, todos os três sítios de glicosilação singular em N- mutantes tem taxas de degradação similares e solubilidade (Samandari e Brown, 1993). Consequentemente, o carbohidrato fixado na N107 (asparagina107) é particularmente importante para a exportação pelo ER.
Depois nós endereçamos a especificidade da conformação da interação ERGIC-53- α1-AT pela análise de duas versões da α1-AT dobradas erradamente conhecidas como as mutantes (α1-ATZ) e Hong Kong (α1-ATHK) (Stoller e Aboussouan,2005). Embora a α1-ATHK seja solúvel e degradada pela degradação associada ao ER envolvendo o proteassomo [omim 600306: proteassomas são complexos proteolíticos responsáveis pela apresentação de antígenos restritos pelo complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe I (Akiyama e outros,1994).], a α1-ATZ se agrega no ER e é submetida à deradação pelo proteossoma e pelo lisossomo (Cabral e outros, 2000; Teckman e outros, 2001).Notavelmente, em nosso YFP PCA, nem a α1-ATHK nem α1-ATZ ligaram-se à ERGIC-53. A α1-ATZ foi expressada em níveis intracelulares similares à YFP2- α1-ATWT e não foi afetada pelos dois inibidores de degradação proteassômica [omim 600306: proteassomas são complexos proteolíticos responsáveis pela apresentação de antígenos restritos pelo complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe I (Akiyama e outros,1994).] a Lactacistina (lactacystin) e a cifunensina (Kifunensine). Nós não pudemos descartar a possibilidade de que a agregação diminua o volume da ERGIC-53 solúvel ligando-se a α1-ATZ competente, dessa forma reduzindo o sinal YFP PCA. No caso da α1-ATHK, a inibição da degradação proteassômica pela lactacistina e cifunensina claramente aumentaram os níveis de YFP- α1-ATHK. Embora a quantidade de YFP2- α1-ATHK fosse desse modo restaurada àquela do manipulado de tipo selvagem, o sinal YFP PCA não foi aumentado. Esses dados sugerem que a interação ERGIC- α1-AT é dependente da conformação e sustenta uma função da ERGIC-53 de controle secundário de qualidade pela captura apenas das proteínas nativas de carga para exportação pelo ER (Ellgaard e Helenius,2003; Appenzeller-Herzog e outros, 2005).
Para confirmar que a ERGIC-53 captura a α1-AT para exportação pelo ER, nós analisamos o transporte da α1-AT endógenos em células HepG2 nas quais a ERGIC-53 foi derrubada por siRNA. O silenciamento da ERGIC-53 por 96 horas reduziu os níveis totais da proteína ERGIC-53 para menos de 20%. Intrigantemente, a derrubada da ERGIC-53 levou a uma acumulação de α1-AT em estabilidade dentro da célula. Esse efeito foi analisado além pelo estudo de transporte e secreção da α1-AT em experimentos de pulso de perseguição usando [S] metionina. A α1-AT é sintetizada como uma glicoproteína com muita manose, é submentida a complexa glicosilação no Goli, e é subsequentemente secretada no meio de cultura. Nas células HepG2 transfectadas com siRNA de controle, a α1-AT de alta manose foi rapidamente convertida nessa forma de complexo glicosilado e aproximadamente metade das proteínas foi secretada após 30 minutos de perseguição. Em contraste, nas células com a ERGIC-53 silenciadas, a α1-AT permaneceu consideravelmente mais tempo em sua forma de muita manose e somente aproximadamente 15% da proteína foi secretada após 30 minutos. A secreção ineficiente da α1-AT não é causada por um defeito geral na secreção porque a secreção da albumina endógena não foi alterada. Além disso, estudos prévios nas células HeLa tem realmente mostrado que nem a depleção nem a localização errada da ERGIC-53 mudam a morfologia da via secretora ou afetam a secreção de toda a proteína. Consequentemente, níveis reduzidos de ERGIC-53 retardam significativamente a secreção da α1-AT de maneira específica.
Para determinar se a secreção remanescente da α1-AT é causada por uma ERGIC-53, nós estudamos o transporte da α1-AT transfectada para dentro de fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) derivados de camundongos sem ERGIC-53 (-/-) e camundongos de tipo selvagem (+/+). Os experimentos de pulso de perseguição revelaram um intervalo de secreção de aproximadamente 60 minutos nas células MEFs. As células MEFs sem ERGIC-53 secretaram no mesmo tempo somente aproximadamente 25% das α1-AT recém sintetizadas e mostraram uma conversão significativamente mais lenta da forma de muita manose para complexo glicosilado da α1-AT. O defeito da secreção em geral pode ser excluído novamente por as MEFs sem ERGIC secretaram fibronectina endógena como as MEFs de tipo selvagem. Esses resultados demonstram que a secreção de α1-AT é significativamente atrasada sem a ERGIC-53 mas que uma alternativa menos eficiente na via de exportação do ER existe.
Se a ERGIC-53 é um receptor de transporte para a α1-AT, a reintrodução da ERGIC-53 certamente corrigirá a secreção defeituosa da α1-AT nas células sem ERGIC-53. De fato, quando a ERGIC-53 humana foi co-expressada com a α1-AT, a α1-AT intracelular foi consideravelmente reduzida nas células MEFs -/- num estado estável. Além disso, a ERGIC-53 aumentou a secreção da α1-AT nas MEFs -/- para o nível das MEFs +/+ após uma hora de perseguição. Consequentemente, a sobre-expressão da ERIC-53 nas MEFs sem ERGIC-53 podem restaurar a secreção de α1-AT completamente. Estudos prévios sobre a função da ERGIC-53 foram baseados principalmente em análises genéticas (Nichols e outros; 1998), estudos de transporte com uma ERGIC-53 mutante retida no ER dominante-negativa (Vollenweider e outros, 1998; Appenzeller e outros, 1999 ), ou a caracterização das interações da ERGIC-53 com as cargas (Appenzeller e outros 1999; Appenzeller-Herzog e outros, 2005; Nyfeler e outros,2005; Zhang e outros, 2005). Os estudos correntes proporcionam agora a evidência direta para uma exportação pelo ER mediada por receptor ativo de proteínas secretadas nas células dos mamíferos. Além disso, nossos dados indicam que os receptores de transporte dão ao transporte de carga mais rapidez e eficiência, mas o transporte de carga não é inteiramente bloqueado na sua ausência. A α1-AT pode possuir um Segundo receptor de transporte ou pode sair do ER por um fluxo volumoso de certa extensão. A abordagem de seleção que nós descrevemos aqui pode ser igualmente aplicada usando-se a α1-AT como uma isca para identificar novos receptores de carga. Com a α1-AT, nós agora identificamos um atrativo modelo de proteína secretada para estudar o mecanismo de exportação de proteína do ER mediado por receptor, em detalhes.
Em conclusão, esse estudo não somente identifica um receptor de transporte intracelular de α1-AT mas também abre uma avenida sem precedentes para a sondagem do genoma em sua amplitude nas interações proteína-proteína na via de secreção. A identificação profícua de uma nova proteína de carga da ERGIC-53 por sondagem de uma fusão do complexo de cDNA-YFP1 com biblioteca baseada em YFP PCA proporciona uma estratégia geral para identificar novos complexos protéicos no lúmen. Com bibliotecas normalizadas e condições ótimas de transfecção, a seleção por saturação e amplo genoma será executável no futuro próximo. Adicionalmente, a YFP PCA tem um potencial promitente para sondagen de alta produtividade de chaperones (proteínas acompanhantes) químicas e moleculares (Burrows e outros,2000) que pode resgatar defeitos de conformação (dobramento) de α1-AT mutantes e fornecer-lhes a secreção competente pela promoção de sua interação com ERGIC-53.
NOTAS
Abbreviations used in this paper: α1-AT, α1-antitrypsin; COPII, coat protein II; ERGIC, ER Golgi intermediate compartment; MCFD2, multiple coagulation factor deficiency protein 2; MEF, mouse embryonic fibroblast; PCA, protein fragment complementation assay.
FONTE:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=18283111
domingo, 5 de julho de 2009
A lectina ligante de manose (MBL) e sua interação com imunoglobulinas na saúde e na doença.
Arnold JN, Dwek RA, Rudd PM, Sim RB.Oxford Glycobiology Institute, Department of Biochemistry, University of Oxford, South Parks Road, Oxford OX1 3QU, United Kingdom.
Nos humanos há cinco classes de imunolobulinas (Igs) : IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, todas as quais são glicoproteínas. As Igs são o principal produto secretado do sistema imune adaptativo, e elas se ligam a antígenos por via de suas sequencias variáveis em suas regiões Fab. A ligação ao antígeno resulta na neutralização ou aglutinação do material ligado e também inicia as funções efetoras por meio das regiões Fc, tais como opsonização e ativação da via clássica do complemento através da ligação ao C1q [O C1q é um dos sub-componentes do Complemento 1: omim 120550: O primeiro componente do complemento é um complexo dependente de cálcio de 3 subcomponentes C1q, C1r e C1s. O subcomponente C1q liga-se a complexos de imunoglobulinas resultando na ativação em série do C1r (enzima), e C1s (pró-enzima), e dos outros oito componentes do sistema complemento. O sub-componente C1q é composto de três diferentes espécies de cadeias, chamadas A, B (C1QB) e C (C1QC).] A lectina ligante de manose (MBL), a molécula de reconhecimento da via de ativação do complemento por lectina, é homóloga ao C1q, em sua estrutura, e se liga de modo dependente de cálcio à manose terminal e aos resíduos de GlcNAc (N-acetilglucosaminil) que tenham sido identificados nos oligossacarídeos ligados na ponta N das Igs. A MBL liga-se aglicoformas não galactosiladas das IgGs (IgG-GO), a formas poliméricas de IgA e a certas glicoformas de IgM que tenham uma alta incidência de glicanos terminando em GlcNAc. Essa interação proporciona uma rota de remoção dos complexos imunes do soro, e um mecanismo de ativação do complemento para patógenos cobertos com Ig. Na doença, a MBL contribui para a inflamação na Artrite Reumatóide, uma condição na qual as concentrações de IgG-GO podem aumentar significativamente em comparação com indivíduos saudáveis. A MBL tem demonstrado recentemente ligar-se a Ig no complexo receptor de célula B, o qual expressa glicosilação anormal da região variável no linfoma folicular.
PMID: 16814399
Arnold JN, Dwek RA, Rudd PM, Sim RB.Oxford Glycobiology Institute, Department of Biochemistry, University of Oxford, South Parks Road, Oxford OX1 3QU, United Kingdom.
Nos humanos há cinco classes de imunolobulinas (Igs) : IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, todas as quais são glicoproteínas. As Igs são o principal produto secretado do sistema imune adaptativo, e elas se ligam a antígenos por via de suas sequencias variáveis em suas regiões Fab. A ligação ao antígeno resulta na neutralização ou aglutinação do material ligado e também inicia as funções efetoras por meio das regiões Fc, tais como opsonização e ativação da via clássica do complemento através da ligação ao C1q [O C1q é um dos sub-componentes do Complemento 1: omim 120550: O primeiro componente do complemento é um complexo dependente de cálcio de 3 subcomponentes C1q, C1r e C1s. O subcomponente C1q liga-se a complexos de imunoglobulinas resultando na ativação em série do C1r (enzima), e C1s (pró-enzima), e dos outros oito componentes do sistema complemento. O sub-componente C1q é composto de três diferentes espécies de cadeias, chamadas A, B (C1QB) e C (C1QC).] A lectina ligante de manose (MBL), a molécula de reconhecimento da via de ativação do complemento por lectina, é homóloga ao C1q, em sua estrutura, e se liga de modo dependente de cálcio à manose terminal e aos resíduos de GlcNAc (N-acetilglucosaminil) que tenham sido identificados nos oligossacarídeos ligados na ponta N das Igs. A MBL liga-se aglicoformas não galactosiladas das IgGs (IgG-GO), a formas poliméricas de IgA e a certas glicoformas de IgM que tenham uma alta incidência de glicanos terminando em GlcNAc. Essa interação proporciona uma rota de remoção dos complexos imunes do soro, e um mecanismo de ativação do complemento para patógenos cobertos com Ig. Na doença, a MBL contribui para a inflamação na Artrite Reumatóide, uma condição na qual as concentrações de IgG-GO podem aumentar significativamente em comparação com indivíduos saudáveis. A MBL tem demonstrado recentemente ligar-se a Ig no complexo receptor de célula B, o qual expressa glicosilação anormal da região variável no linfoma folicular.
PMID: 16814399
sábado, 4 de julho de 2009
A DIMERIZAÇÃO TRANSITÓRIA E A INTERAÇÃO COM ERGIC-53 (LMAN1) OCORREM NO RECEPTOR DE FATOR 3 DE CRESCIMENTO DO FIBROBLASTO NAS VIAS SECRETÓRIAS PRIMÁRIAS.
Lievens PM, De Servi B, Garofalo S, Lunstrum GP, Horton WA, Liboi E.
A VIA DE SECREÇÃO DO RECEPTOR DE FATOR DE CRESCIMENTO DO FIBROBLASTO 3 (FGFR3) INCLUI A GLICOSILAÇÃO LIGADA EM NO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO, ONDE UM SISTEMA DE CONTROLE RIGOROSO ASSEGURA QUE SOMENTE OS RECEPTORES CORRETAMENTE DOBRADOS CHEGUEM À SUPERFÍCIE CELULAR DE ONDE O FGFR3 FUNCIONAL MADURO SINALIZA SOBRE A DIMERIZAÇÃO MEDIADA PELO LIGANTE. NÓS MOSTRAMOS PREVIAMENTE QUE A AUMENTADA ATIVIDADE DE CINASE ASSOCIADA AO FGFR3 PRODUZINDO A MUTAÇÃO NA DISPLASIA DE TIPO II TANATOFÓRICA (QUE LEVA À MORTE) (TDII) EMBARAÇA SUA (DO FGFR3) MATURAÇÃO, CAPACITANDO O RECEPTOR A SINALIZAR A PARTIR DO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO. AQUI NÓS INVESTIGAMOS SE ESSE DISTÚRBIO BIOSINTÉTICO PODERIA SER EXPLICADO PELA DIMERIZAÇÃO PREMATURA DO RECEPTOR. NOSSAS OBSERVAÇÕES MOSTRAM QUE UMA FRAÇÃO LIMITADA DO RECEPTOR MUTANTE IMATURO COM MUITA MANOSE DIMERIZA NAS VIAS SECRETÓRIAS PRIMÁRIAS, COMO O FGFR3 IMATURO DE TIPO SELVAGEM. EM CONTRASTE, O RECEPTOR DE TIPO SELVAGEM MADURO E FARTAMENTE GLICOSILADO ATINGE A SUPERFÍCIE CELULAR COMO MONÔMERO SUGERINDO QUE A DIMERIZAÇAO É UM EVENTO TRANSITÓRIO. A ATIVIDADE DE CINASE DO FGFR3 MUTANTE NÃO É REQUERIDA PARA QUE OCORRA A DIMERIZAÇÃO, EMBORA AUMENTE A EFICIÊNCIA DA DIMERIZAÇÃO. ALÉM DISSO, O FGFR3 MUTANTE TRANSFOSFORILA O RECEPTOR IMATURO DE TIPO SELVAGEM INDICANDO QUE A DIMERIZAÇÃO OCORRE NO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO. A VISUALIZAÇÃO DA INTERAÇÃO PROTÉICA DENTRO DA VIA SECRETÓRIA CONFIRMA A DIMERIZAÇÃO DO RECEPTOR. EM ADIÇÃO, ISSO MOSTRA QUE AMBOS O TIPO SELVAGEM E O FGFR3 TDII INTERAGEM COM A LECTINA DE MANOSE ESPECÍFICA ERGIC53. NÓS CONCLUÍMOS QUE UMA DIMERIZAÇÃO TRANSITÓRIA É UMA ETAPA OBRIGATÓRIA NA BIOSÍNTESE DO FGFR3 AGINDO COM UM MECANISMO DE CONTROLE DE QUALIDADE DA PRÉ-REUNIÃO. ALÉM DISSO, A FORMAÇÃO DO COMPLEXO TDII/ERGIC-53 PODE FUNCIONAR COMO UM PONTO DE CONTROLE PARA A FONTE DE FGFR3 A SEGUIR NO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO. ESSES ACHADOS TÊM IMPLICAÇÕES NO ENTENDIMENTO DA PATOÊNESE DAS DESORDENS RELACIONADAS COM O FGFR3.
PMID: 18577465
Lievens PM, De Servi B, Garofalo S, Lunstrum GP, Horton WA, Liboi E.
A VIA DE SECREÇÃO DO RECEPTOR DE FATOR DE CRESCIMENTO DO FIBROBLASTO 3 (FGFR3) INCLUI A GLICOSILAÇÃO LIGADA EM NO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO, ONDE UM SISTEMA DE CONTROLE RIGOROSO ASSEGURA QUE SOMENTE OS RECEPTORES CORRETAMENTE DOBRADOS CHEGUEM À SUPERFÍCIE CELULAR DE ONDE O FGFR3 FUNCIONAL MADURO SINALIZA SOBRE A DIMERIZAÇÃO MEDIADA PELO LIGANTE. NÓS MOSTRAMOS PREVIAMENTE QUE A AUMENTADA ATIVIDADE DE CINASE ASSOCIADA AO FGFR3 PRODUZINDO A MUTAÇÃO NA DISPLASIA DE TIPO II TANATOFÓRICA (QUE LEVA À MORTE) (TDII) EMBARAÇA SUA (DO FGFR3) MATURAÇÃO, CAPACITANDO O RECEPTOR A SINALIZAR A PARTIR DO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO. AQUI NÓS INVESTIGAMOS SE ESSE DISTÚRBIO BIOSINTÉTICO PODERIA SER EXPLICADO PELA DIMERIZAÇÃO PREMATURA DO RECEPTOR. NOSSAS OBSERVAÇÕES MOSTRAM QUE UMA FRAÇÃO LIMITADA DO RECEPTOR MUTANTE IMATURO COM MUITA MANOSE DIMERIZA NAS VIAS SECRETÓRIAS PRIMÁRIAS, COMO O FGFR3 IMATURO DE TIPO SELVAGEM. EM CONTRASTE, O RECEPTOR DE TIPO SELVAGEM MADURO E FARTAMENTE GLICOSILADO ATINGE A SUPERFÍCIE CELULAR COMO MONÔMERO SUGERINDO QUE A DIMERIZAÇAO É UM EVENTO TRANSITÓRIO. A ATIVIDADE DE CINASE DO FGFR3 MUTANTE NÃO É REQUERIDA PARA QUE OCORRA A DIMERIZAÇÃO, EMBORA AUMENTE A EFICIÊNCIA DA DIMERIZAÇÃO. ALÉM DISSO, O FGFR3 MUTANTE TRANSFOSFORILA O RECEPTOR IMATURO DE TIPO SELVAGEM INDICANDO QUE A DIMERIZAÇÃO OCORRE NO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO. A VISUALIZAÇÃO DA INTERAÇÃO PROTÉICA DENTRO DA VIA SECRETÓRIA CONFIRMA A DIMERIZAÇÃO DO RECEPTOR. EM ADIÇÃO, ISSO MOSTRA QUE AMBOS O TIPO SELVAGEM E O FGFR3 TDII INTERAGEM COM A LECTINA DE MANOSE ESPECÍFICA ERGIC53. NÓS CONCLUÍMOS QUE UMA DIMERIZAÇÃO TRANSITÓRIA É UMA ETAPA OBRIGATÓRIA NA BIOSÍNTESE DO FGFR3 AGINDO COM UM MECANISMO DE CONTROLE DE QUALIDADE DA PRÉ-REUNIÃO. ALÉM DISSO, A FORMAÇÃO DO COMPLEXO TDII/ERGIC-53 PODE FUNCIONAR COMO UM PONTO DE CONTROLE PARA A FONTE DE FGFR3 A SEGUIR NO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO. ESSES ACHADOS TÊM IMPLICAÇÕES NO ENTENDIMENTO DA PATOÊNESE DAS DESORDENS RELACIONADAS COM O FGFR3.
PMID: 18577465
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